Application Note ImageXpressマイクロハイコンテントイメージャーシステムを用いた
ミトコンドリアの形状と分布の測定

PDF版（英語）

はじめに

ミトコンドリアの応答を評価することは、細胞の健康に対する化学物質の特異性を決定するためにしばしば用いられる。これらの応答は、MitoTracker™色素のような蛍光インジケータの強度によって示されるように、ミトコンドリアが安定した膜電位を維持する能力を含むことがある。その他の測定可能な反応としては、細胞内のオルガネラの形態や分布の変化がある。

ハイコンテントイメージャーでは、マイクロプレート内で培養・処理した細胞を、洗浄工程なしに生きたままイメージングすることができ、最も自然な状態の細胞をリアルタイムで研究することができます。高倍率、共焦点光学系、Zプレーンの収集を組み合わせることで、3D画像を生成し、その後3Dボリュームとして解析できるため、すべての細胞から得られる情報量が大幅に増加する。

これらのアッセイは、ImageXpress® マイクロコンフォーカルハイコンテントイメージングシステムとMetaXpress® ハイコンテント画像解析ソフトウェアを用いて、自動化されたスクリーニング環境で行うことができます。

材料

MitoTracker Orange CMTMRos（Life Technologies P/N M7510）
WI-38ヒト肺線維芽細胞（P12）
ロテノン
クロロキン
384ウェル黒色透明底マイクロプレート（BD Falcon P/N 353962）
ヘキスト33342核染色
ImageXpress Micro Confocalハイコンテントイメージングシステム

アッセイ方法

WI-38細胞を384ウェル組織培養処理マイクロプレートに1ウェルあたり50μL、7,500個プレーティングした。37℃、5％CO2インキュベーター内で30分間接着させた。その後、ウェルを3つの異なる濃度のロテノンまたはクロロキンで30分間処理した。最後に、6倍濃度のMitoTracker Orange + Hoechstを各ウェルに10μLずつ加え、最終濃度を100nMのミトコンドリア色素と5μMのHoechstとした。90分間のインキュベーション後、プレートをImageXpress® Micro ConfocalシステムでDAPIおよびTRITCフィルターセットを用い、40Xまたは60X Plan Apo対物レンズでイメージングした（図1）。

***図1. 60X対物レンズで撮影した生の2Dプロジェクション画像。
50 μMロテノン（上）とクロロキン（下）で処理した細胞のミトコンドリア。

データ解析

ImageXpress®マイクロ共焦点システムでイメージングされた細胞は、MetaXpress®ソフトウェアで3D解析モジュールを用いて可視化され、解析された。段階的なユーザー入力により、モジュールは核を正確にセグメンテーションし、ミトコンドリアを凝縮型か伸長型かに分類するだけでなく、ミトコンドリアの総個体数に関する測定値を出力し、ミトコンドリアの個別の形態に関する測定値を提供する。zシリーズからの3Dレンダリングにより、画像セグメンテーションマスクが生画像の対象オブジェクトを正確に識別していることを確認できるだけでなく、解析の対象となる形態学的および空間的パラメーターを強調表示することができます。