Application Note ヒト心筋細胞における肥大反応を決定するための
BNP発現と細胞サイズのモニタリング

  • 形態の変化を可視化
  • 複数の肥大パラメーターを一度に定量化
  • 96ウェルおよび384ウェルプレートで心筋細胞をスクリーニングすることにより、スループットを最大化
  • アダプターを用いた統計的に有意なサンプル数の収集
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はじめに

心肥大は、心筋梗塞、虚血、高血圧、弁膜症など多くの心臓病と関連する病態であり、環境汚染物質や医薬品の副作用としても観察される。心筋梗塞や虚血、高血圧、弁膜症、また環境汚染物質や医薬品の副作用としても観察される。肥大の古典的なバイオマーカーの一つはB型ナトリウム利尿ペプチド（BNP）であり、これは肥大した心臓細胞で過剰に産生される1。

人工多能性幹細胞（iPSC）由来の心筋細胞をハイコンテントイメージングアッセイでモニタリングすることにより、化合物の毒性またはスクリーニングのエンドポイントとして、肥大の発症または改善をそれぞれハイスループットで測定することができる。したがって、これらのアッセイは、薬理試験や疾患モデリングによる医薬品開発の両方で使用される表現型スクリーニングプロセスにとって、頑健かつ有用なツールである2。

以下の実験では、ヒトiPS細胞由来のiCell®心筋細胞（Cellular Dynamics Intl. これらの細胞は、生来の心筋細胞の生化学的、電気生理学的、力学的、病態生理学的特性を再現することが示されており、エンドセリン-1（ET-1）で細胞を誘導することにより、肥大の疾患モデルが作成された。肥大を抑制する化合物の有効性は、自動化されたImageXpress® Micro High-Content Screening SystemとMetaXpress® Softwareを用いて定量化し、BNP発現と細胞面積を測定した2。

高含量スクリーニング用アッセイ

心肥大をアッセイするための詳細なプロトコール1は、Cellular Dynamics Internationalから入手できる。ハイコンテントスクリーニングに対応しやすい一般的なワークフローを図1に示す。総反応量は384ウェルプレートで通常40μLであった。

図1. ハイコンテントイメージングと解析によるスクリーニングのアッセイワークフロー。

データ収集はImageXpress Micro Systemで行った。画像は2つの異なる波長（DAPIとCy5フィルターを使用）で10倍または20倍の倍率で収集され、384ウェルプレートの1ウェルあたり1000個以上の細胞を調べるのに十分な部位を自動的に収集するための適応的収集が行われた。データ解析はMetaXpress SoftwareのMulti-Wavelength Cell Scoring Moduleを用いて行った。

肥大に関連する分子および細胞バイオマーカーのハイスループットスクリーニング

化合物の毒性による病的な心肥大は、多くの分子的・細胞的変化によって特徴づけられる。ヒト心筋細胞におけるこれらの変化を捉えることは簡単であり、ハイスループットのワークフローに適合する。以下の例は、分子および細胞肥大バイオマーカーの測定を例証するものである。

分子バイオマーカーの変化の定量化

BNPの増加は、心肥大時に発現が変化する多くのタンパク質の一つである。ここでは、蛍光抗体でBNPを標識して細胞質のBNP染色を測定することにより、ハイコンテントイメージングを用いてBNPの発現を決定した（図2A）。この実験では、iCell心筋細胞をET-1の10倍希釈系列で処理した。化合物処理の対数濃度に対して細胞あたりのBNPシグナルをプロットすることにより、心筋細胞におけるET-1誘導BNP発現の用量反応曲線を作成した（図2B）。次に、ET-1の用量反応からEC50値を生成するために、この曲線を適合させた。

図2A. ET-1添加前後のiCell心筋細胞におけるBNP発現。未処理のiCell心筋細胞（左）または10nM ET-1で18時間刺激したiCell心筋細胞（右）の画像。細胞はBNP発現を検出する抗体（赤）で標識し、核はHoechst 33342（青）で染色した。画像は20倍の倍率で取得した。BNPシグナルの面積からBNP発現レベルを算出した1。

図2B. この代表的な384ウェル実験では、指示濃度のET-1で刺激した後、BNP発現の用量依存的増加が起こった。ET-1のEC50値は24pMであった（平均±SEM；曲線上の各点についてn＝4）1。

細胞サイズの変化の定量化

細胞サイズの増大とアクチン細胞骨格の構造的再編成は、肥大反応の細胞的特徴としてよく知られている2。iCell心筋細胞をET-1で誘導し、染色した後、ImageXpress Micro Systemで画像化した。肥大した心筋細胞は、未処理の細胞よりも目に見えて大きくなっていた。細胞サイズの増大はMetaXpressソフトウェアを用いて定量化され（図3）、BNP検出の場合と同様のEC50値が得られた。

図3. 未処理（左）と10nM ET-1誘導（中）のiCell心筋細胞の画像は細胞サイズの違いを示している。細胞体の大きさを決定するためにAlexa Fluor 488標識ファロイジンを用い（緑）、核はHoechst 33342で染色した（青）。画像は20倍の倍率で取得した。細胞サイズ（平方ミクロン）の変化は、EC50値11pM（平均±SEM；n=3）のET-1の滴定に対して定量化した（右）2。

早期創薬にハイスループット・スクリーニングとヒト生物学を導入する

肥大と心不全は創薬の一般的な治療領域である。ImageXpress Micro Systemのハイスループット機能とヒト幹細胞由来の組織細胞との組み合わせは、創薬スクリーニングの初期段階でヒト生物学にアクセスするための完全なシステムを提供する。概念実証として、心筋細胞を各阻害剤の10ポイント用量で四重反復処理した後、1nM濃度のET-1で刺激した。阻害活性を示した化合物のうち5つは、ベラパミル（カルシウム拮抗薬）、BEZ-235（P13K-mTOR二重阻害薬）、シクロスポリンA（カルシニューリン阻害薬／免疫抑制薬）、フェノフィブラート（高脂血症治療薬）、SAHA（幅広いヒストン脱アセチル化酵素阻害薬）2である（図4）。

図4. 複数の化合物プロファイリング実験から代表的なデータをプロットした。 iCell心筋細胞を培養4日目に、ET-1（1 nM）で18時間肥大を誘導する前に、化合物の希釈系列で1時間処理した（384ウェルフォーマット）。BNP発現の変化は、化合物の滴定に対して定量した。ベラパミル（黒丸）が最も強力な阻害剤で、IC50値は35 nMであった2。

概要

ヒトiPSC由来の心筋細胞は、心肥大をモデル化するためのin vitro細胞系を提供する。これらの薬剤誘導心筋細胞をモニターするためにハイコンテントスクリーニングを用いることで、治療の副作用としての心肥大の測定が可能になるとともに、抗肥大化合物を試験するためのモデル系の構築が可能になる。BNP発現レベルや細胞サイズの変化のような複数のパラメーターを1つのアッセイで得ることができるので、肥大反応の微妙な指標も観察することができる。さらに、96ウェルおよび384ウェルアッセイフォーマットと、ImageXpress Micro High Content Screening SystemおよびMetaXpress Software Multi-Wavelength Cell Scoring Moduleを利用した自動イメージングおよび解析を組み合わせることにより、疾患モデル研究および薬理学的試験の両方において、マイクロプレートでの表現型スクリーニングが容易になる。

参考文献

  1. 心肥大のモデル化： Endothelin-1 Induction with High Content Analysis, iCell Cardiomyocytes Application Protocol, Cellular Dynamics International, January 2014. https://www.cellulardynamics.com/products/lit/CDI_iCellCM-Hypertrophy_ET1_HighContent_AP.pdf
  2. ヒトiPS細胞由来心筋細胞を用いた表現型スクリーニング： HTSCompatible Assays for Interrogating Cardiac Hypertrophy, Carlson, C., et al., J Biomol Screen, 2013, 18(10):1203-11, doi:10.1177/1087057113500812.

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