Application Note SpectraMax i3プラットフォームと
MiniMaxサイトメーターによる細胞毒性モニタリング

はじめに

アポトーシスは、がんや神経変性疾患のみならず、胚発生においても重要なプロセスである。アポトーシスと細胞生存率のアッセイは、細胞死のメカニズムに関する情報を提供できる。マイクロプレートリーダーアッセイでは、しばしばホールウェル発光アッセイや蛍光アッセイの出力が用いられますが、これらのアッセイとイメージングサイトメトリーを組み合わせることで、さらに多くの情報を収集することができます。SpectraMax® i3 Multi-Mode Detection Platformを使用すると、ウェル単位または細胞単位でアポトーシスと細胞生存率を測定できるだけでなく、細胞の外観をモニターしてアッセイの品質を管理することもできます。

細胞ベースアッセイのセットアップ

HeLa細胞を384ウェル黒壁クリアボトムマイクロプレートにウェル当たり5000細胞プレーティングし、一晩増殖させた。翌日、アポトーシス誘導化合物アニソマイシンの連続希釈液をセルに添加した。20時間後、アポトーシスと細胞生存率を測定した。

アポトーシスは、カスパーゼ-3またはカスパーゼ-7が活性化されたアポトーシス細胞で緑色の蛍光シグナルを発するCellEvent Caspase 3/7 Green Detection Reagent（Life Technologies社製、商品番号C10423）を用いてモニターした。アポトーシス細胞はSpectraMax® MiniMax™ Imaging Cytometerを用いて細胞数解析により検出した。細胞生存能は、CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability assay (Promega Cat. #G7570)を用いて定量した。このルシフェラーゼベースのアッセイは、アッ セイウェル中のATP量、つまり代謝活性細胞量に比例した発光 シグナルを生成する。発光は SpectraMax i3 プラットフォームを用いて検出した。すべてのデータは、SoftMax® Proソフトウェアを使用して収集および解析された。また、細胞はMiniMaxイメージングサイトメーターの明視野イメージングモードを用いて画像化し、視覚的な品質管理を行った。

結果

処理20時間後、アニソマイシンは濃度依存的にアポトーシスを誘導し、アポトーシス細胞は緑色の蛍光を示した（図1）。

明視野画像は、アポトーシスと一致するアニソマイシン処理細胞の丸まりを示した。カスパーゼ活性はアニソマイシンの濃度が高くなるにつれて増加し、一方ATPレベルは低下した（図2）。

結論

蛍光イメージングと発光ベースのアッセイを組み合わせることで、細胞の健全性をより完全に評価することができる。アポトーシスに不可欠なイベントであるカスパーゼ-3/7活性の蛍光イメージャーを発光ATPアッセイと組み合わせ、細胞生存率をモニターした。明視野画像は、品質管理に使用できる細胞形態に関する情報を提供した。

SpectraMax i3プラットフォームとMiniMaxイメージングサイトメーターは、イメージングの利点とマルチモードプレートリーダーアッセイの多用途性を組み合わせた理想的なプラットフォームである。SoftMax Proソフトウェアは、データ収集から解析までのシンプルなワークフローを提供し、ユーザーによるアップグレードが可能なカートリッジオプションにより、このシステムはインテリジェントな投資となります。

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