Application Note ImageXpress Pico自動細胞イメージングシステムによる
細胞表現型のマルチパラメトリック評価
- 様々な細胞表現型をキャプチャすることで、自動イメージングの効率性を学ぶ
- 設定済みの解析モジュールを使用して数値データを取得する
- 化合物処理に対する様々な形態学的変化の評価
PDF版（英語）
はじめに
マシュー・ハマー、オクサナ・シレンコ（PhD）｜アプリケーションサイエンティスト｜モレキュラー・デバイス
自動細胞イメージング法は、形態、生存率、マーカー発現を含む細胞の表現型に対する化合物の影響を解析するための効率的な方法である。ここでは、ImageXpress® Pico自動細胞イメージングシステムとCellReporterXpress自動イメージングおよび解析ソフトウェアが、化合物効果の表現型解析にどのように応用されているかを示す。イメージングと解析の方法は、細胞生存率の評価、細胞形状の特徴づけ、細胞接着と拡散、細胞骨格の完全性、ミトコンドリア電位など、複数のリードアウトの特徴づけのためのツールを提供する。
材料
- HeLa細胞（ATCC P/N: CCL-2）
- HeLa培地
◦DMEM：CellGro、L-グルタミン入り（コーニング）
◦10% FBS (BenchMark™; Gemini P/N 100-106)
◦1% ペニシリン/ストレプトマイシン
- スタウロスポリン（Sigma P/N S5921）
- マイトマイシンC（Sigma P/N M4287）
- パクリタキセル（Sigma P/N T7402）
- エトポシド（Sigma P/N E1383）
- ドキソルビシン（Sigma P/N D1515）
- カルセインAM
- EarlyToxライブセルアッセイキット（Explorer Kit、Molecular Devices P/N R8342）
- Hoechst 33342（Thermo Fisher, Carlsbad, CA P/N H3570）
- MitoTracker Orange cMTMRos（Thermo Fisher, Carlsbad, CA, M7510）
- AF488標識ファロイジン（サーモフィッシャーサイエンティフィック、カリフォルニア州カールスバッド、PN A12379）
- 384ウェル黒色透明底マイクロプレート（Corning Falcon P/N 62406-490）
- ImageXpress Pico 自動細胞イメージングシステムおよび CellReporterXpress 自動イメージング・解析ソフトウェア
方法
細胞の表現型の変化に対する化合物の効果をモニターするために、HeLa細胞を細胞増殖を阻害し、細胞死を誘導することが知られている薬剤で処理した。HeLa細胞を、384ウェルの黒色透明底マイクロプレートに、1ウェルあたり2,000細胞、培地総量25μLの密度でプレーティングし、37℃、5% CO2で24時間インキュベートした。その後、細胞をスタウロスポリン、マイトマイシンC、パクリタキセル、エトポシド、ドキソルビシンなどの化合物の連続希釈液で72時間処理した。化合物処理はトリプリケートまたはクアドラプリケートで行った。
化合物処理72時間後、細胞をいくつかの色素の組み合わせで染色した：核色素Hoechst 33342、生存率色素Calcein AM、および膜電位がインタクトなミトコンドリア（MMP）を検出するためのMitoTracker Orange™ CMTMRos試薬。2倍の染色液を培地に直接添加した。すべてのウェルの最終染色濃度は、3 µM Hoechst 33342、0.2 µM MitoTracker Orange CMTMRos、および1 µM Calcein AMであった。細胞を染色液とともに37℃、5% CO2で30分間インキュベートした。
Hoechst、Calcein AM、MitoTracker Orangeの染色には、それぞれDAPI、FITC、TRITCチャンネルを用い、細胞を生細胞イメージングすることができる。対物レンズは10倍を使用し、1ウェルにつき1部位の画像を取得した。露光時間はDAPIで20ms、FITCで10ms、TRITCチャンネルで200msとした。後でイメージングするため、あるいは細胞マーカーを追加してさらに処理するために、セルを固定することもできる。注：Calcein AMは生細胞の評価に使用し、固定後は検出できない（データは示さず）。MitoTracker OrangeおよびHoechst 33342核染色は固定後も安定である。
アクチン細胞骨格の完全性を評価するために、細胞を固定した。ミトトラッカーオレンジとヘキスト33342染色で染色した後、細胞を4％ホルムアルデヒド溶液で固定し、その後PBSで2回洗浄した。その後、細胞膜をDPBS＋0.01％サポニン＋1％FBSで10分間透過処理した。細胞骨格の完全性を評価するために、AlexaFluor® 488（AF488）標識ファロイジン染色を用いた。ファロイジンを透過化バッファーで希釈し（1:50）、37℃で2時間セルとインキュベートした。細胞をPBSで洗浄した後、CellReporterXpressソフトウェアから、AF488で染色した細胞骨格を持つ細胞を定量するために最適化されたCell Scoring解析モジュールを用いてイメージングと解析を行った。
生細胞または固定細胞をImageXpress Picoシステムでイメージングし、CellReporterXpressソフトウェアで解析した。1つはFITCをマーカーとして検出し、カルセインAMまたはファロイジン陽性細胞の数を定量化するもので、もう1つはTRITCをマーカーとして検出し、ミトコンドリア染色陽性細胞を分析するものである。両分析プロトコールとも、細胞数と核の特徴付けには核染色を用いた。
図1. 細胞生存能と形態のマルチパラメトリック解析のための画像と解析マスク。HeLa細胞を複数の化合物で72時間処理した後、核染色（Hoechst 33342）、アクチン細胞骨格染色（AlexaFluor 488（AF488）標識ファロイジン）、ミトコンドリア染色（MitoTracker Orange CMTMRos）を行った。代表的な画像と解析マスクは、コントロール細胞と0.1μMスタウロスポリンで処理した細胞の比較を示す。細胞は、10X Plan Fluor対物レンズを備えたImageXpress Picoシステムを用いて、DAPI、FITC、TRITCチャンネルでイメージングした。画像（上）は、核（青）、アクチン細胞骨格（緑）、ミトコンドリア（オレンジ）を標識している。ファロイジン陽性細胞（中）とMitoTracker Orange陽性細胞（下）の定量用に最適化されたCell Scoring解析モジュールを用いて、CellReporterXpressソフトウェアで画像を解析した。その結果得られた解析マスクを示す（薄緑＝アクチン陽性核、濃緑＝アクチン細胞骨格、青色＝ミトコンドリア陽性核、赤色＝ミトコンドリア陰性核、橙色＝無傷のミトコンドリア）。
自動イメージングと解析による表現型効果の定量化
典型的な自動細胞ベースアッセイのワークフローには、細胞のプレーティング、化合物による処理、自動イメージングが含まれます。マルチカラー、マルチパラメーターアッセイでは、Calcein AMを使用して、生細胞数またはインタクト細胞数を定義し、細胞拡散を特徴付け、細胞形態を同定することができる。核色素は、細胞の計数、増殖の評価、核の強度や形状の測定に使用されます。MitoTracker色素は、ミトコンドリアの完全性や膜電位の測定に使用できます。細胞は生細胞イメージングすることもできるし、固定し、細胞骨格やその他のリードアウトに関する情報を提供するために追加試薬（例えばファロイジン）で染色することもできる。アクチン細胞骨格のファロイジン染色は、細胞骨格の組織化、細胞の広がり、形態の評価、無傷細胞数の定量に使用できる。
CellReporterXpressソフトウェアは、あらかじめ設定された解析モジュールにより画像取得と解析を同時に行うことができ、アッセイ結果の作成を効率化します。セルスコアリングは、細胞生存能、ミトコンドリアの健全性、あるいは細胞骨格の完全性を分析するために最適化された。解析は、総セル数、マーカー特異性細胞数の仕様、マーカーの強度と積分強度値、総細胞面積と平均細胞面積、平均面積と強度の核の特徴を含むがこれらに限定されない複数の読み出しを生成した。
図1は、核色素Hoechst、アクチン細胞骨格色素AlexaFluor 488（AF488）標識ファロイジン、ミトコンドリア電位評価用MitoTracker Orange色素の3つの色素で染色したコントロールとスタウロスポリン処理細胞の合成イメージングを示す。検出された核、インタクトなアクチン細胞骨格、およびインタクトなミトコンドリアに対応する解析マスクが、両処理条件下で表示されている。
図2. 用量反応曲線は、様々なパラメータに対する化合物処理の効果を示す。HeLa細胞はImageXpress Picoシステムでイメージングし、CellReporterXpressソフトウェアで解析した。セルスコアリングモジュールは、AlexaFluor 488 Phalloidinで染色されたインタクトなアクチン細胞骨格と、MitoTracker Orangeで標識されたインタクトなミトコンドリアを有する細胞を測定するように最適化された。4パラメータのロジスティック曲線プロットは、CellReporterXpressで生成したデータポイントを用いて、SoftMax® Proソフトウェアを用いて作成した。用量反応曲線は、いくつかのリードアウトについて、各化合物の効果を示している。対応する EC50 値は表 1 にある。
各測定値の濃度依存性を図2に示す。ファロイジン染色された細胞の総数によって決定される生存可能細胞は、化合物の濃度が高くなるにつれて減少した（図2）。MitoTracker陽性セルについても同様の傾向が観察された。ファロイジン染色とMitoTracker染色の強度の減少も、細胞毒性化合物の濃度が高くなるにつれて一致していた。細胞拡散への影響は、細胞面積を評価することで特徴付けることができる。異なる読み出しに対するEC50値を表1にまとめた。
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EC 50 (µM) ± Standard Deviation |
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|---|---|---|---|---|---|
| 解析読み出し | Staurosporine | Mitomycin C | Paclitaxel | Etoposide | Doxorubicin |
| アクチン陽性セル数 | 0.012 ± 0.001 | 0.178 ± 0.140 |
5.46 x 10 -4 ± 3.48 x 10 -5 |
0.820 ± 0.340 | 0.020 ± 0.012 |
| アクチン陽性セル総面積 | 0.067 ± 0.009 | 4.952 ± 0.354 |
8.56 x 10 -4 ± 5.69 x 10 -5 |
13.54 ± 1.229 | 0.649 ± 0.054 |
| アクチン陽性セル総強度 |
0.008 ± 7.45 x 10 -4 |
0.164 ± 0.093 |
3.95 x 10 -4 ± 2.82 x 10 -5 |
0.603 ± 0.239 | 0.012 ± 0.007 |
| アクチン陽性セル積算強度 | 0.038 ± 0.005 | 3.614 ± 0.378 |
6.33 x 10 -4 ± 4.21 x 10 -5 |
10.10 ± 1.301 | 0.501 ± 0.078 |
| ミトコンドリア陽性セル数 | 0.013 ± 0.001 | 0.110 ± 0.045 |
4.50 x 10 -4 ± 2.64 x 10 |
0.543 ± 0.190 | 0.014 ± 0.006 |
| ミトコンドリア陽性セル積算強度 | 0.017 ± 0.002 | 1.691 ± 0.222 |
4.18 x 10 -4 ± 2.98 x 10 -5 |
6.336 ± 1.086 | 0.197 ± 0.053 |
| ミトコンドリア陽性セル総強度 |
0.009 ± 9.81 x 10 -4 |
0.094 ± 0.039 |
3.35 x 10-4 ± 3.00 x 10 -5 |
0.451 ± 0.147 | 0.013 ± 0.005 |
表1. 解析リードアウトのEC50値。セルスコアリングモジュールは、複数の表現型変化に対する化合物の効果を示す複数のリードアウトを解析する。EC50値は図2の4パラメータロジスティック曲線プロットに対応する。
結論
結論
自動細胞イメージング法は、毒性、細胞生存能、形態に対する化合物の影響を調べるための効率的なツールである。様々な細胞応答を調べることができるため、作用機序に関する重要な情報が得られる。ImageXpress Pico自動細胞イメージングシステムとCellReporterXpressソフトウェアにより、ユーザーは様々な測定値を解析し、複雑な表現型効果をよりよく特徴付けるために複数の読み出しを可能にすることができる。
PDF版（英語）