Application Note ヒトiPSC由来心筋細胞における
化合物誘導性催不整脈作用の
マルチパラメトリック評価
- iPSC心筋細胞表現型アッセイを用いたCiPA心毒性化合物の特性評価
- 最大100枚/秒の画像を記録するHS EMCCDカメラによるカルシウムピークの解像度の向上
- 新しいScreenWorks Peak Pro 2ソフトウェアによるピークの特性解析の強化
PDF版（英語）
はじめに
Oksana Sirenko | Senior Research Scientist | Molecular Devices
Krithika Sridhar | Manager, Software Engineering | Molecular Devices
Carole Crittenden | Applications Scientist | Molecular Devices
化合物のスクリーニングや毒性評価のための生物学的に適切で予測可能な細胞ベースアッセイの開発は、創薬における大きな課題である。本研究の焦点は、ヒト人工多能性幹細胞（iPSC）由来の心筋細胞を用いて、ハイスループットスクリーニングに適合する心毒性アッセイ法を確立することであった。in vitroの催不整脈モデルとしてのヒトiPSC由来心筋細胞の有用性を評価するため、CiPAイニシアチブ1によって提案された化合物リストの中から、低、中、高次のTdP（torsades de pointes）リスクカテゴリーに関連する28の薬剤に対する濃度依存性と反応を評価した。
心筋細胞の収縮速度と自発活動のパターンに対するさまざまな化合物の影響は、カルシウム感受性色素を用いた高速カイネティック蛍光で測定した細胞内カルシウムオシレーションの変化によってモニターした。Ca2+振動パターンのマルチパラメトリックな特徴付けを行うために、高度な画像解析法を導入した。さらに、ハイコンテントイメージャーを用いて、心筋細胞の生存能、細胞骨格の再配列、ミトコンドリア電位に対する化合物の影響を評価した2。この表現型アッセイでは、細胞の生存率や形態学的特性だけでなく、拍動周波数、振幅、ピーク幅、立ち上がり時間、減衰時間などのパラメーターの特性評価も可能である。この結果は、in vitroで薬剤による催不整脈作用を検出するためのiPSC心筋細胞の有用性を示している。
FLIPR Pentaシステムによるカルシウムオシレーションの評価
iPSC由来心筋細胞は、自発的に同期したカルシウムオシレーションを起こす。FLIPR® Pentaハイスループットセルラーイメージングシステムを用いた高速蛍光イメージングにより、Molecular Devices EarlyTox™心毒性キットを用いて、細胞内Ca2+レベルの変化からモニターされる心筋細胞のCa2+振動のパターンと頻度を測定した。このアッセイでは、28種類の既知の心毒性化合物に加えて、いくつかのベンチマーク化合物および陰性対照化合物がテストされました。
インストゥルメンテーション
FLIPR Pentaシステムは、新しい高速カメラと新しいScreenWorks® Peak Pro 2ソフトウェアモジュールを搭載しています。
この装置にはScreenWorks Peak Pro 2ピーク解析ソフトウェアモジュールが搭載されており、iPSC由来の心筋細胞や神経細胞に関連する一次ピークや二次ピーク、複雑なオシレーションパターンの解析と特性評価が可能です。ScreenWorksソフトウェアで利用可能なパラメーターの一部を図2に示す。
図2. 新しいScreenWorks Peak Pro 2ソフトウェアには、観察された表現型の変化について20以上の記述子を用いたピーク解析のための追加ツールが装備されている。細胞内Ca2+オシレーションはEarlyTox心毒性キットを用いて評価した。
方法
iPSC由来心筋細胞
実験には、セルラー・ダイナミクス・インターナショナル（CDI）のiCell® Cardiomyocytes2から凍結保存したヒトiPSC由来細胞を用いた。細胞を解凍し、20,000/ウェル（96ウェルフォーマット）または10,000/ウェルで384ウェルフォーマットのプレート（コーニング）にプレーティングし、維持培地中で7日間培養した。培養における強い同期収縮の存在は、実験を行う前に目視で確認した。ImageXpress® マイクロコンフォーカルハイコンテントイメージングシステム上でのiPSC心筋細胞におけるカルシウムフラックスに伴う蛍光の変化の例を図1に示す。
図1. ImageXpress® Micro Confocalシステムを用いて測定したカルシウムオシレーション。カルシウム色素を負荷したiPSC心筋細胞の0.2秒タイムラプス画像。
心筋細胞は化合物に15、30、60、90分、24時間、または図に示すように曝露した。
カルシウムオシレーションアッセイ
細胞内カルシウムオシレーションは、EarlyToxカルシウム色素（カタログ番号R8210、Molecular Devices）を用いて評価した。通常のプロトコールに従い、測定2時間前にセルに色素を負荷した。セルは様々な時間化合物に暴露された。画像は1～2分間、0.03秒ごとに撮影した。ピークの特性評価には ScreenWorks Peak Pro 2 ソフトウェアを使用した。パラメータの例を図 2 に示す。
セル染色
表現型の変化を評価するため、生存率色素 Calcein AM（1μM）、ミトコンドリア電位色素 MitoTracker Orange（0.2μM）、および Hoechst 核色素（2μM）の 3 種類の色素の混合物を用いて細胞を生細胞染色した（すべて Life Technologies 社製）2。
結果
カイネティックパターンの記録と解析
Cellular Dynamics Int.社のiCell心筋細胞2。富士フイルム株式会社のiCell心筋細胞2にEarlyTox Cardiotoxicity Kitを負荷し、上述の化合物で処理した。細胞生存能は24時間のエンドポイントで評価した。自発的カルシウムオシレーションは、複雑なオシレーションパターンを最適に解像できるように、1秒間に30～50フレームで記録した。ScreenWorks Peak Pro 2ソフトウェアの高度な解析方法を利用して、Ca2+フラックスオシレーションパターンのマルチパラメトリック特性評価を行った。この表現型アッセイにより、オシレーション周波数、振幅、ピーク幅、ピーク時間、減衰時間、不規則性などのリードアウトの特性評価が可能になった。さらに、EAD様（early-after depolarization like event）パターン、ピーク延長、ピーク不規則性の出現が評価された。
化合物の表現型効果
iPSC由来心筋細胞におけるカルシウムオシレーションの測定は、毒性評価の有望な方法である。本研究では、臨床データに基づき、Torsades de Pointのリスクが高、中、低に分類された28種類のCiPA化合物の評価に焦点を当てた。Torsades de Pointsは、これらの薬剤によって引き起こされる可能性のある心拍不整であり、しばしば致死的リスクを高める。いくつかの試験薬による代表的なカルシウムオシレーションパターンの例を図3に示す。ピークカウント、振幅、ピーク高さ90％におけるピーク幅の増加（CTD90）、およびピーク高さ20％から80％までの減衰時間に関する濃度応答曲線とEC50値を図4に示す。
図3. 新しい高速EMCCDカメラ（FLIPR Pentaシステム）を用いて、カルシウム感受性色素を用いた細胞内Ca2+オシレーションの速度とパターンに対する様々な化合物の影響を検証した。3a) FLIPR Pentaシステムを用いて、384ウェルプレート全体のハイスループット記録と解析を同時に行った。3b) 対照サンプルと化合物処理サンプルのカルシウムオシレーションの代表的なトレースを示す。セルに色素を2時間負荷した後、化合物で30分間処理した。濃度依存的なパターンの変化が観察された。オシレーショントレースはFLIPR Pentaシステムで2分間記録した。パターンはScreenWorks Peak Pro 2ソフトウェアで解析した。化合物のトレースは赤で、コントロールは黒で示した。
図4. 平均ピーク速度、ピーク間隔、およびピーク延長の変化に関する濃度依存性および算出 EC50 値。
心毒性作用のマルチパラメトリック評価
このアッセイは、in vitroにおける化合物の心毒性作用をハイ・プットで評価できる可能性があり、さまざまな薬剤や新規化合物を評価し、優先順位をつけてさらに試験を進めるのに役立ちます。ScreenWorks Peak Pro 2ソフトウェアでは、20以上の波形の記述子を使用できます。我々は、オシレーションの変化を記述するためのマルチパラメトリックアプローチを評価しました。表1は、心臓のTorsades de Point（TdP）症候群のリスクに関連する薬剤のパラメトリック測定値を示しています。
| 化合物 | ドフェチリド | アジミリド | ソタロール | キニジン | シサプリド | クロザピン | イソプロテレノール | ベラパミル | DMSOコントロール |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| TdP risk 1 |
High | High | High | High | Int | Int | Low | Low | None |
| Cmax (μM) 1 |
0.002 | 0.07 | 15 | 3 | 0.003 | 5.2 | 0.1 | 0.1 | 効果なし |
| Peak count EC 50 (μM) 2 |
0.004 | 2.1 | 13.1 | 3.36 | <0.1 | 5.2 | 0.1 | 0.2 | 効果なし |
| Amplitude EC 50 (μM) 2 |
~0.3 | 15.3 | ~100 | 320 | 10 | 2.6 | 32 | 0.07 | 効果なし |
| Fold peak width increase | 0.1 | 5.9 | 25.4 | 0.1 | ~1 | 効果なし | 減少 | 減少 | 効果なし |
| EAD-like event* | 0.01 | 0.3 | 15 | 3 | 0.06 | – | – | – | – |
| Peak prolongation* | 0.01 | 0.3 | 3 | 1 | 0.06 | – | – | – | – |
| Oscillation irregularity* | 10 | – | 3 | 10 | 2 | – | – | – | – |
| Fibrillation* | 10 | – | – | – | – | – | 200 | 1 | – |
| Oscillation stop* | – | – | – | 10 | 20 | 7 | – | 3 | – |
| 24 hour cytotoxicity* | – | 30 | – | 10 | – | – | – | – | – |
TdPリスクとCmax 2 ScreenWorks Peak Pro 2ソフトウェアによるEC50値
* ScreenWorks Peak Pro 2ソフトウェアによる異なるリードアウトで特異的変化を引き起こした最低濃度（μM）。
変化が観察されなかった場合は、"-"で示した。表1. 表現型アッセイの結果。心筋梗塞治療薬の3つのリスクレベルは、ピーク特性や細胞毒性を含む複数のパラメータによって特徴付けられる。
心毒性作用のマルチパラメトリック評価
iPSC由来心筋細胞の形態と生存率に対する化合物の影響を特徴付けるために、共焦点イメージングと画像解析法を用いた。細胞毒性効果を評価するため、化合物で24時間処理した後、細胞をImageXpress® Micro Confocalシステムでイメージングした。画像は、全細胞、生細胞（カルセインAM陽性細胞）、インタクトなミトコンドリアを有する細胞（ミトトラッカー陽性細胞）の細胞数を検出するためのCell Scoringアルゴリズムを用いて解析した。結果を図5に示す。
図5. 10μMの標記化合物で24時間処理した心筋細胞を、核染色（Hoechst 33342、青）、生存率染色（Calcein AM、緑）、ミトコンドリア膜電位染料MitoTracker Orange CMTMRos（赤）で2時間染色した複合画像（それぞれ2μM、1μM、0.5μM）。細胞をDAPI、FITC、TRITC、フィルターキューブ、10X Plan Fluor対物レンズでイメージングした。アジミリド、ベプリジル、キニジン、アステミゾールについては、10μM以上の濃度で24時間後に細胞毒性が観察された。クラリスロマイシン、テルフェニジン、タモキシフェン、バンデテニブに関する同様のデータは示していない。
概要
- 高速度カメラを搭載したFLIPR Pentaシステムにより、心筋細胞におけるカルシウムオシレーションパターンの分解能が向上した。
- 新しいソフトウェアScreenWorks Peak Pro 2は、20種類以上のパターン記述子を用いて、複雑なイベント解析とパターンの詳細な特性解析を可能にする。
- 私たちは、化合物の効果と潜在的な心毒性を評価するためにiPSC由来の心筋細胞を使用する方法を開発し、その実現可能性を実証しました。
- 28種類の既知の不整脈誘発物質（CiPA化合物）を用いて、様々な表現型反応が示された。代表的なデータを示す。
- これらのアッセイは、開発中の薬剤の試験や、潜在的な心毒性に対する化学物質のスクリーニングに使用できる。
参考文献
- Blinovaら、2018、Cell Reports 24、3582-3592、2018年9月25日
- Sirenkoら、Toxicol Appl Pharmacol. 2017
- Kopljarら、Stem Cell Reports 2018年
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