Application Note 単一プラットフォームでの心筋細胞の
マルチパラメトリックアッセイ

はじめに

Cathy Olsen, PhD | Sr. Applications Scientist | Molecular Devices
Jayne Hesley | Applications Scientist | Molecular Devices
Oksana Sirenko, PhD | Research Scientist | Molecular Devices

幹細胞由来のヒト心筋細胞は、ネイティブなヒト心筋細胞と同様の表現型特性と電気生理学的プロファイルを持っている。培養中の心筋細胞は拍動する合胞体を形成することができ、この合胞体は生来の心筋細胞と同様の挙動を示す。細胞の同期収縮に伴って起こる細胞内カルシウムレベルのオシレーションは、カルシウム感受性色素を用いてモニターすることができ、治療によるオシレーションパターンの変化は、蛍光シグナルの経時変化でモニターすることができる。

心筋細胞の収縮に伴う細胞内カルシウムフラックスの変化は、蛍光イメージプレートリーダー（FLIPR® Tetraシステム）やSpectraMax® Paradigm®マルチモードマイクロプレートリーダーでモニターできることが示されています。このたび、SpectraMax® i3/i3x マルチモードマイクロプレートリーダーとSpectraMax® MiniMax™ 300イメージングサイトメーターを組み合わせることで、心筋細胞の拍動の検出と細胞生存率の蛍光イメージングが1台の装置で可能になりました。化合物によって誘発される拍動数の変化を細胞生存能と相関させることで、心毒性をより正確に評価することができます。

方法

心筋細胞に対する化合物の影響を評価するため、EarlyTox™心毒性キットを用いて、SpectraMax i3/i3xリーダーで心拍アッセイを実施した。 iCell心筋細胞（Cellular Dynamics International社のヒトiPS細胞由来心筋細胞）を、同期拍動層が形成されるまで384ウェルマイクロプレートで培養した。次に、細胞をScreen-Well Cardiotoxicity Library（Enzo Life Sciences社）の化合物で10μMで24時間処理し、拍動と生存率に対する化合物の影響を評価した。

心筋細胞の拍動パラメータは、カイネティック測定、ウェルごとの蛍光測定モードを使用してSpectraMax i3/i3xリーダーで測定し、SoftMax® ProソフトウェアのPeak Proソフトウェアアルゴリズムを使用して解析した。ピークカウント、ピーク頻度、ピーク振幅、ピーク幅、減衰時間など、16の解析パラメーターが算出された。この例では、ピークカウント（25秒間の読み取り中に測定されたピークの数）を用いて、心拍に対する化合物の影響を定量化した。

ピーク数の減少を引き起こした化合物の毒性の可能性に関する追加情報を得るために、化合物処理と拍動測定後に、緑色蛍光生存率色素カルセインAMで生細胞を染色した。細胞は、SpectraMax i3/i3xリーダーのフィールドアップグレード可能なオプションであるMiniMaxサイトメーターを用いてイメージングした。SoftMax Proソフトウェアでは、セルカウント、細胞増殖、マーカー発現など、複数の細胞解析メソッドが利用可能です。化合物の毒性による細胞生存能の変化は、細胞増殖解析プロトコルを用いて解析し、各ウェルにおけるカルセインAM染色した生存細胞で覆われた面積を測定した。

心筋細胞の拍動と生存率イメージングを組み合わせた解析により、細胞に対する影響の異なる化合物が同定された。コントロールウェルの平均ピークカウントは、25秒の読み取り時間あたり12ピークであり、ピークカウントが著しく減少したウェルは、ソフトウェアによって容易に識別できた。

いくつかの化合物は一般的に細胞毒性であると同定され、ピークカウントの大幅な減少を引き起こし、生存細胞で覆われたパーセンテージの減少を引き起こした。パーセントの面積が減少した。他の化合物は、細胞の生存率に影響を与えることなく心筋細胞の拍動に悪影響を及ぼし、ピークカウントが低く、生存細胞で覆われた面積の割合が高いことが証明された。

プレーティングビューは、拍動パターンに対する化合物の影響と細胞生存率との相関を簡単に視覚的にチェックすることができる。図1は、心拍動（上）と生存細胞に覆われた面積（下）の両方のデータのプレートビューを示している。図2には、心筋細胞に対する作用が異なる化合物について、個々のカイネティックのトレースのより詳細なビューと代表的な画像が示されている。

ピークカウントを劇的に減少させるいくつかの化合物は、全体的な細胞生存率にはほとんど影響しないことが示された。例えば、不整脈の治療に広く使われている薬剤であるジゴキシンは、ピークカウントを25秒間におよそ12回という測定値から1、2回に減少させた。しかし、細胞被覆面積は71％であったのに対し、DMSOで処理した対照群では82％であった。ドーパミンインバースアゴニストであるハロペリドールは、生存率に影響を与えることなく、拍動プロファイルに明確な影響を与えた。スタウロスポリンのような他の化合物は、細胞生存率とピーク数の両方を大きく減少させた（図2）。

結論

SpectraMax i3/i3x リーダーとSpectraMax MiniMax サイトメー ターの組み合わせにより、心筋細胞の拍動の検出と細胞生存能の 蛍光イメージングを1台の装置で行うことができ、SoftMax Pro ソフトウェアによる統合データ解析が可能です。化合物によって誘発される心拍数の変化や異常なリズムは、細胞生存能と相関させることができる。SpectraMax i3/i3xリーダーを用いた心筋細胞の拍動に対する濃度依存的影響が、いくつかの参照化合物について実証された。

MiniMaxサイトメーターを用いて、心筋細胞拍動をモニターしたウェルと同じウェルにおける細胞毒性効果を画像化した。カルシウムフラックスや細胞生存能のような機能的リードアウトを全く同じウェルで測定することで、心筋細胞の機能や全体的な細胞毒性に対する化合物の影響に関する補足的な情報が得られる。

MiniMax サイトメーター付き SpectraMax i3/i3x リーダーは、イメージングの利点とマルチモードプレートリーダーアッセイの多用途性をシームレスに組み合わせている。SoftMax Proソフトウェアは、データ収集から解析までのシンプルなワークフローを提供します。