Application Note SpectraMax Lマイクロプレートルミノメーターでの
MycoAlertマイコプラズマ検出アッセイ（ロンザ社製）

はじめに

マイコプラズマ感染は、汚染された細胞の形態、生存率、代謝を変化させるため、細胞培養士にとってコストのかかるものである。マイコプラズマは最も小さく単純な原核生物であり、生合成能力が限られているため、多くの栄養素を宿主に完全に依存している。マイコプラズマによる細胞培養の混入は、pH変化や濁りを生じないため検出が困難であり、抗生物質による培養は、この "目に見えない "脅威を抑止する効果はほとんどない。

Lonza Walkersville, Inc.のMycoAlert Mycoplasma Detection Assayは、特定のマイコプラズマ酵素の活性を利用した生化学的検査に基づいています。これらの酵素の存在により、迅速なスクリーニングが可能となり、検査サンプル中の汚染マイコプラズマを高感度で検出することができます。テストでは、生きているマイコプラズマは溶解し、解放された酵素はADPのATPへの転換を触媒作用させるMycoAlertの基質と反応する

MycoAlert基質の添加前と添加後の両方でサンプル中のATPレベルを測定することにより、マイコプラズマの有無を示す比率を得ることができる。これらの酵素が存在しない場合、2回目の測定値は1回目の測定値より増加しません。生きているマイコプラズマが存在する場合、MycoAlert基質中の特異性基質と反応し、ATPを生成する。このATPの増加は、以下の生物発光反応を使って検出することができます：

発光強度は ATP 濃度に直線的に関係する。MycoAlert アッセイの発光シグナルは、SpectraMax® L マイクロプレートルミノメーターと Molecular Devices 社の SoftMax® Pro ソフトウェアに含まれる設定済みプロトコルを使用して検出しました。

方法

MycoAlertアッセイコントロールを用いた感度試験

MycoAlert Assay Control（Lonza）の各種希釈液100µLサンプルを、白色壁の96ウェルルミノメータープレート（Porvair）のトリプリケートウェルにプレーティングした。100μLのMycoAlert試薬（MycoAlert Bufferで再構成；Lonza）を各ウェルに加え、室温で5分間インキュベートした。プレートをSpectraMax Lルミノメーターにプレーティングし、SoftMax® ProソフトウェアのMycoAlertプロトコルを使用して、選択した各ウェルの1秒間の積算読み取り値を取得した（読み取り値A）。100μLのMycoAlert基質（MycoAlert Bufferで再構成）を各ウェルに直ちに加え、プレートを室温で10分間インキュベートした。プレートをSpectraMax Lルミノメーターにセットし、選択した各ウェルの1秒間の積算読み取り値を測定しました（読み取り値B）。インストゥルメンテーションの設定は表1を参照。

* これらの設定は、SoftMax Proソフトウェアの事前設定済みMycoAlertプロトコルに含まれています。

MycoAlert比は、Read BをRead Aで割って算出した。

マイコプラズマ感染細胞を用いた感受性試験

マイコプラズマ・ヒオルヒニスに感染したヒト白血病細胞K562を封じ込めたフラスコから、細胞培養上清のサンプル2mLを取り出した。細胞上清を400 x gで5分間回転させ、存在するセルを除去した。(細胞の存在はATPのバックグラウンドレベルの上昇につながり、低レベルのマイコプラズマ感染の検出をマスクする可能性がある）。

清澄化した培養上清の100µLサンプルを、白色壁の96ウェルルミノメータープレート（Porvair社製）のトリプリケートウェルにプレーティングした。100μLのMycoAlert試薬（MycoAlert Bufferで再構成；Lonza）を各ウェルに加え、室温で5分間インキュベートした。プレートをSpectraMaxルミノメーターにセットし、選択した各ウェルの1秒間の積算読み取り値を測定した（読み取り値A）。100μLのMycoAlert基質（MycoAlert Bufferで再構成）を各ウェルに直ちに加え、プレートを室温で10分間インキュベートした。プレートをSpectraMax Lルミノメーターにセットし、選択した各ウェルの1秒間の積算読み取り値を測定しました（読み取り値B）。

MycoAlert 比率は、読み取り値 B を読み取り値 A で割ることにより計算されました（図 2 参照）。マイコプラズマに感染しているセルでは、通常1より大きい比率が得られます。

結果

MycoAlert アッセイは陰性サンプル中の非常に低レベルの ATP を検出するため、ルミノメーターには発生する低レベルの光を高感度で検出することが要求されます。Lonzaが提案するガイドラインでは、ルミノメーターはMycoAlertアッセイコントロールの最低1:32希釈を検出できる必要があります。

SpectraMax L ルミノメーターは、提案された 1:32 希釈以上の MycoAlert コントロールの希釈系列を直線的に検出します。低レベルの光を検出するこのルミノメーターの感度の高さは、MycoAlert の使用に適していることを証明しています。

このルミノメーターの感度テストは、マイコプラズマ感染セルから生成されたサンプルを用いてさらに調査された。このサンプル中のマイコプラズマの確定数は不明であったが、MycoAlert Mycoplasma Detection AssayとSpectraMax Lルミノメーターの組み合わせにより、大きな検出窓が得られた。

結論

Molecular Devices社のSpectraMax LマイクロプレートルミノメーターとSoftMax Proソフトウェアは、Lonza社のMycoAlert Mycoplasma Detection Assayと組み合わせることで、マイコプラズマ検出分野における迅速で高感度な技術の組み合わせを研究者に提供します。高感度で検出範囲が広いため、マイコプラズマ混入がすぐに検出され、細胞培養の混入モニタリングにかかる貴重な時間を節約できる。

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