Application Note SpectraMax i3x マルチモードマイクロプレートリーダーに
搭載されたNanoBRETテクノロジー

はじめに

キャシー・オルセン博士｜Sr.アプリケーションサイエンティスト｜モレキュラー・デバイス

タンパク質間相互作用（PPI）は、細胞機能やシグナル伝達に不可欠である。PPIを研究するために、共免疫沈降法やプルダウン法、蛍光共鳴エネルギー移動法（FRET）などの蛍光法など、多くの方法が採用されてきた。蛍光法はレーザーや高出力ランプによる試料の励起に依存するため、しばしば光退色やバックグラウンド蛍光の問題が生じやすく、有用性が制限されることがある。別の方法である生物発光共鳴エネルギー転移（BRET）は、酵素ルシフェラーゼによって触媒される化学反応を利用して光を発生させる。光励起がないため、BRETは外部光源によるサンプル照明がもたらす問題を回避できる。

プロメガ社のNanoBRET™テクノロジーは、NanoLuc® LuciferaseをBRETドナーとして、NanoBRET 618蛍光体で標識されたHaloTag®タンパク質をアクセプターとして使用します。赤色シフトしたアクセプターは、ドナーとアクセプターの発光スペクトルの重なりを減らし、ドナーとしてレニラ・ルシフェラーゼ、アクセプターとしてYFPまたはGFPを用いる他のBRET法よりも優れたSN比を可能にします。

ここでは、SpectraMax® i3x マルチモードマイクロプレートリーダーのNanoBRETアッセイでの検証を示します。オンボードのルミネッセンス検出モードを使用することもできるが、より高い感度を得るために、定量下限を4倍向上させるNanoBRET検出カートリッジをリーダーに装備することもできる。

材料

• 白色96ウェルプレート
• 0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)を封じ込めた1Xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)
• NanoBRET Control タンパク質パネル - 以下の分画量を5バイアル：
  ◦NanoBRETコントロールタンパク質1：0
  ◦NanoBRET コントロールプロテイン2：0.1
  ◦NanoBRET コントロール タンパク質 3: 1
  ◦NanoBRET コントロール タンパク質 4: 10
  ◦NanoBRET コントロールタンパク質 5: 100
• NanoBRET Nano-Glo基質（NanoBRET検出システムの一部）
• SpectraMax i3x マルチモードマイクロプレートリーダー
• NanoBRET検出カートリッジ

方法

プロメガ社から提供された NanoBRET コントロールタンパク質を用いた in vitro プロトコルを実行してインストゥルメンテーションを検証し、検出限界を推定した。NanoBRET活性タンパク質を封じ込めた標準品を96穴ソリッド白色マイクロプレートにプレーティングし、NanoBRET測定を行った。これらの測定値を用いて線形回帰計算を行い、機器性能を測定する定量下限（LOQ）値を算出しました。

検証法はSpectraMax i3xリーダーでカスタムNanoBRET検出カートリッジまたはオンボードルミネッセンス検出光学系のいずれかを用いて実行した。両方の結果を示す。

アッセイ法

• コントロールタンパク質 50 µL を 96-well プレート内のトリプリケートウエルに分注する。
• NanoBRET Nano-Glo Substrate の 20 µM 溶液を 1X PBS/0.1% BSA に調製する（5 mM のストック試薬を 250 倍希釈）。
• 各ウェルに 50 µL の基質を添加し、最終濃度を 10 µM とする。
• 基質添加後 10 分以内に NanoBRET 対応ルミノメーターでドナー発光（例 450nm）とアクセプター発光（例 610nm）を測定する。

データ分析

• 以下の式で NanoBRET 比を求める： アクセプターサンプル / ドナーサンプル .
• 各データの平均 NanoBRET 比と SD を決定する： 0％、0.1％、1％、10％、100％。
• 0%セットの平均比率を他のすべてのセットから引き、補正した NanoBRET 比率を求めます。
• 補正した NanoBRET 比をプロットし、線形回帰分析を行って傾きを計算する。曲線はx,y = 0を強制的に通るようにする（アクセプター非存在下ではBRETが起こらないため）。
• 定量限界(LOQ)を計算する。これは、全ドナー集団に対するBRETペアの最小割合（占有率）を表し、ドナーのみと統計的に区別できる： LOQ = (10 * SD 0% sample )/slope.

結果／結論

NanoBRET 検出モジュールを用いた SpectraMax i3x リーダーの LOQ は 0.58%であった（図 1）。オンボード発光検出モードを用いた場合のLOQは2.6％であった。NanoBRET 検出モジュールは感度が高いのでシグナルが弱いアッセイに有効である。