Application Note FLIPR膜電位アッセイキットを用いた
NaV1.5チャネルアッセイの最適化

はじめに

キャロル・クリッテンデン｜アプリケーションサイエンティスト｜モレキュラー・デバイス

電位依存性イオンチャネルは、心臓、骨格筋、脳、神経細胞の興奮性細胞膜に存在する。このようなチャネルを遮断したり、調節したりすることで、治療効果が得られたり、正常な細胞機能を阻害したりする可能性がある。そのため、電位依存性イオンチャネルに作用する化合物は、創薬における重要なターゲットとなっている。心筋NaV1.5チャネルは "テトロドトキシン（TTX）抵抗性 "に分類される1。NaV1.5チャネルの薬理学的意義は、抗不整脈薬の作用標的であり、リドカインのような局所麻酔薬によっても遮断されることである2。

伝統的な電気生理学の観点からは、NaV1.5チャネルはリドカインのようないくつかの化合物によって状態依存的および使用依存的な阻害を示す。状態依存的阻害とは、チャネルが特定の電圧依存的なコンフォメーション状態（例えば、閉、開、不活性化）にあるとき、阻害剤がチャネルにより結合しやすくなることを意味する。使用依存性阻害とは、電圧パルス列のような反復刺激によって、特定の化合物による阻害が蓄積することを意味する。パルス列によってチャネルは電圧依存的なコンフォメーション状態を循環するため、使用依存的な化合物はその結合部位により累積的にアクセスすることになる。

FLIPR®膜電位（FMP）アッセイキットは、電位依存性イオンチャネルを調節または遮断する化合物による膜電位の変化を検出するための、迅速で信頼性の高い蛍光ベースの方法を提供します。試験化合物と膜電位色素との相互作用により蛍光応答が変化し、リード化合物の活性が変化することがこれまでに示されています4。

モレキュラー・デバイセズ社は、FLIPR膜電位アッセイキットの2つの異なる無洗浄製剤を開発しました： ブルーとレッドです。各キットは同じ特許済みインジケーター色素を使用し、異なるクエンチャーと組み合わせることで、データのばらつきの原因を排除しながら、セルライン／チャンネル／化合物の適用性を最大化します。ライブラリー中の化合物の化学的特性、化合物の自家蛍光の違い、あるいは色素が細胞のタイプや受容体に及ぼす影響によっては、一方のキットの方が他方よりも優れた反応を示す場合があります。アッセイ開発中、最適な化合物の反応は、スクリーニングするライブラリーの代表サンプルを用いて両方のキットを試験することにより、経験的に決定することができます。本アプリケーションノートでは、心筋NaV1.5チャネルをトランスフェクトしたCHLセルを用いて、テトロドトキシンとリドカインによる膜電位アッセイ機能の違いを示し、FLIPR Tetra®システムを用いたFLIPR膜電位レッドアッセイキットとブルーアッセイキットの両方による最適化結果を示します。

材料

• セルライン CHL（チャイニーズハムスター肺細胞）で安定発現させた電位依存性ナトリウムチャネルNa V 1.5
• 培地 ダルベッコ変法イーグル培地（サーモフィッシャー社製 #11995）、5％ウシ胎児血清（Hyclone cat. #SH30071.03）、1％Pen/Strep/グルタミン（サーモフィッシャー社製 #103786）、450μg/mL Geneticin（サーモフィッシャー社製 #10131-035）
• アッセイバッファー： フェノールレッド無添加HBSS（サーモフィッシャー社製、#14025092）および20mM HEPES（サーモフィッシャー社製、#15630080）
• FLIPR 膜電位アッセイキット（モレキュラー・デバイス社製、赤のカタログ番号R8123、青のカタログ番号R8034）
• 384ウェル黒色壁、滅菌、TC処理、透明底プレート（Corning cat.）
• ナトリウムチャネル調節薬：
  ◦ベラトリジン (シグマ社製 #V-5754) 
  ◦リドカイン (シグマ社製 #L-7757)
  ◦テトロドトキシン (シグマ社製 #T-8024)
• FLIPR Tetraシステム（モレキュラー・デバイス社製）

方法

アッセイプレート調製

384ウェルアッセイプレートを作成するため、NaV1.5細胞をトリプシン処理し、培養液に再懸濁し、黒壁透明底の384ウェルプレートに1ウェルあたり25μLで12,500個/ウェルプレーティングした。マイクロプレートは、湿度95%、CO2 5%の条件下、37℃で一晩培養した。

FLIPR膜電位アッセイ

膜電位アッセイを調製するため、FMP Red Assay explorer-kit試薬バイアル1本とFMP Blue Assay explorer-kit試薬バイアル1本を、それぞれ10mLのアッセイバッファーで完全に溶解し、プレート2枚分の色素負荷バッファーを調製した。セルプレートをインキュベーターから取り出し、培地を除去したり洗浄したりすることなく、25μLの赤色色素負荷バッファーをプレートの各ウェルに直接加えた。FLIPR Tetra Systemで測定する前に、色素負荷プレートを37℃で30分間インキュベートした。FLIPR Tetraシステムは表1に示すセットアップパラメーターを用いて準備した。ポリプロピレン製384ウェルプレートに、電圧依存性ナトリウムチャネルオープナーであるベラトリジンを5倍濃度、ナトリウムチャネルブロッカーであるリドカインおよびTTXを5倍濃度で封じ込めた濃度反応系列を調製した。FLIPR Tetraシステムを用い、ベラトリジンをNaV1.5セルプレートに添加してナトリウムチャネルを開口させ、細胞膜の偏光解消に伴う蛍光の変化を記録した。ベラトリジンの80%最大応答に対する有効濃度（EC80）を決定した。オフラインで、12.5μLの10Xチャネルブロッキング化合物を色素負荷細胞プレートに追加添加し、室温で15分間インキュベートした。FLIPR Tetraシステム上で、5XベラトリジンをEC80濃度で添加し、膜偏光解消中の蛍光変化を記録した。アッセイ終了後、リドカインとテトロドトキシンのIC50濃度を決定した。結果は、グラフ作成ソフトGraphPad Prism 6を用いてグラフ化した。

表1. 膜電位アッセイ用のFLIPR Tetraシステムの設定（384ウェルプレート）。

結果

ベラトリジン：チャネルオープナー

電気生理学的アッセイでは、細胞膜に電圧を印加してナトリウムチャネルを開状態にし、その後急速に不活性化状態に移行させる。これに対し、膜電位蛍光アッセイでは、ベラトリジンを用いてナトリウムチャネルを開状態に保持し、これまで報告されてきた6つの毒素結合部位のうち、2番目の部位に結合することで不活性化を防ぐ5。図1に示すように、FMP RedとBlueアッセイキットを用いたベラトリジンに対する細胞反応の比較は類似している。FMP Redアッセイキットを用いた場合のEC50濃度は26.6μMで、FMP Blueアッセイキットを用いた場合の20.6μMに比べ、わずかに右シフトしている。

テトロドトキシン：チャネル遮断薬

テトロドトキシン（TTX）は日本のフグから単離された強力なナトリウムチャネル遮断薬である。EC80用量のベラトリジンを添加する15分前に、5倍の用量反応系列をNaV1.5セルに添加し、チャネル開口部をブロックした。その結果、FMP RedのIC50は6.2μM、FMP BlueのIC50は6.3μMであった。蛍光の変化はFMPアッセイ間で同等であった（図2）。また、FMPレッドアッセイキットのZ因子6は0.68、ブルーアッセイキットのZ因子6は0.78であった。Molecular Devices社のIonWorks® Quattro Systemを使用して作成した電気生理学的アッセイを使用して収集したTTXの用量濃度応答曲線（図3）は、2.4μMのIC50値を示している。膜電位アッセイの結果は、公表されている従来のパッチクランプデータと同様である1。

リドカイン：使用依存性チャネル遮断薬

リドカインは局所麻酔薬で、ナトリウムチャネルを使用依存的に遮断することで作用する。図4のパネルAでは、パルス1からパルス10までの電流を比較し、パルストレインとローデータのNa+電流を示している。リドカインの用量反応曲線を図4のパネルBに示す。パルス1対パルス10で測定されたIC50値は、それぞれ886μMと262μMであった。パルストレインがパルス1からパルス10に進むにつれて、閉状態、開状態、不活性化状態が循環し、リドカインが開状態および不活性化状態に曝露される累積時間が増加するため、使用依存性の証拠が存在する。リドカインへの曝露の増加は、パルス10に対する用量反応曲線の測定値の左方シフトとして現れる。

図5のFLIPR膜電位アッセイキットの結果から、FMP RedのIC50は約52.4μM、FMP BlueのIC50は約135.6μMであった。FMPレッドアッセイキットとFMPブルーアッセイキットのZ'ファクターは同等であった。電気生理学的アッセイと比較して、このアッセイでより高い効力の測定が期待されるのは、ベラトリジンがチャネルを開いたコンフォメーション状態にロックし、チャネルがリドカインに最大に曝露されるため、見かけ上の効力が増大するからである。FLIPRアッセイで同定された興味のある化合物について、自動パッチクランプ法によるフォローアップスクリーニングを行うことが推奨される。

結論

ベラトリジンは、調節化合物を同定するためのハイスループット膜電位スクリーニング戦略の一環として、ナトリウムチャネルを開くために電圧の代わりに使用することができる。電気生理学的アッセイにおけるパルス1でのIC50値と比較すると、FMPアッセイにおけるリドカインのIC50値ははるかに小さく、これは以前の発表と一致しており、CHLのほとんどのNaV1.5チャネルが閉鎖状態にないことを示唆している。2つのキットオプションが利用可能であるため、特異性細胞や化合物クラスに対して最良の結果が得られるように膜電位アッセイを最適化することが可能である。本研究では、FLIPR膜電位レッド＆ブルーアッセイキットの両方が、テトロドトキシンやリドカインと同様に、ベラトリジンで良好な結果を示した。

参考文献

1. J. TTX感受性を持つTTX抵抗性心筋ナトリウムチャネルの変異体。Science 1992; 256:1202-1205.
2. W.A.キャタール、A.L.ゴールディン、S.G.ワックスマン。国際薬理学連合。XLVII. 電位依存性ナトリウムチャネルの命名法と構造機能相関。Pharmacol Rev 2005; 57:397-409.
3. B. ヒレ 励起膜のイオンチャネル, Edn. Third. (Sinauer Associates, Sunderland; 2001).
4. C. Wolff, B. Fuks, P. Chatelain. (2003) 膜電位感受性蛍光プローブの比較研究とイオンチャネルスクリーニングアッセイにおける使用。J Biomol Screen, 8, 533 - 543.
5. S. Cestele, R.B. Ben Khalifa, M. Pelhate, H. Rochat, D. Gordon. ラット脳と昆虫のナトリウムチャネルにα-サソリ毒素が結合すると、ブレベトキシンとベラトリジンによるアロステリック調節が異なることが明らかになった。J Biol Chem 1995; 270: 15153-15161.
6. J. Zhang, et. ハイスループットスクリーニングアッセイの評価とバリデーションに使用するシンプルな統計パラメータ、J Biomol Screen 1999, Vol. 4, (2) 60-73.