Application Note SpectraMax iD3またはiD5マイクロプレートリーダーでの
Transcreener FIアッセイ用に最適化されたセッティング

はじめに

ミーラ・クマール｜ベルブルック研究所
ジョイス・イタタニ｜アプリケーションサイエンティスト｜モレキュラー・デバイス
Cathy Olsen｜Sr.アプリケーションサイエンティスト｜モレキュラーデバイス

Transcreener® HTSは、何千もの細胞酵素によって形成されるヌクレオチドの検出に基づく、普遍的なハイスループットの生化学アッセイプラットフォームです。これらの酵素の多くは、細胞シグナリングの中心となる共有結合制御反応を触媒し、創薬のターゲットとして大きな価値があります。

トランスクリーナー® FI アッセイは、赤色蛍光強度（FI）の出力でヌクレオチドを直接検出するシングルステップの競合的イムノアッセイです。すべてのアッセイの試薬は、高特異性モノクローナル抗体-クエンチャー結合体に結合した赤色トレーサーです。標的酵素が産生するヌクレオチド二リン酸が抗体-クエンチャー結合体からトレーサーを置換し、蛍光強度が増加する（図1）。赤色トレーサーを使用することで、蛍光化合物や光散乱による干渉を最小限に抑えることができる。Transcreener アッセイ FI アッセイは、1 回添加、混合＆測定形式の HTS 用に特別に設計されています。

バリデーション基準

Transcreener HTS アッセイの利点を実現するための重要なファクターは、データ出力に使用するマイクロプレートリーダーの正しいセットアップです。光学部品の適切な選択とその他の設定は、任意のアッセイに対するインストゥルメンテーションの感度に影響を与える。この種の標準曲線は酵素反応を模倣しているため、10 μM ATP/ADP 標準曲線（24 レプリケート）を実行することで、Transcreener HTS アッセイの機器性能の主要なパラメータが特定された。10 μM の ATP から開始し、ADP を徐々に添加し、ATP をそれに比例して減少させ、アデニンヌクレオチドの総濃度を 10 μM に維持した。Z'>0.5の条件を決定するために積分時間を変化させた。インストゥルメンテーションをTranscreener FIアッセイで使用するには、10μM ATPの10%変換でZ'>0.7が必要です。

サンプルFI標準曲線

ADP:ATPの比率が増加するにつれて、結合トレーサー対遊離トレーサーの割合が減少し、RFU値が全体的に増加します。1%～100%の変換率を表すADP:ATP比からなる15ポイントの標準曲線を持つアッセイプレートを、SpectraMax® iD5 マルチモードマイクロプレートリーダーで読み取りました。

材料

• トランスクリーナー® ADP 2 FI（3013）
• トランスクリーナー® GDP FI（3014）
•  ATP/ADP 混合物： 10 mM MgCl2、20 mM HEPES、pH 7.5、0.01% Brij-35、およびATP/ADP（一定のアデニン濃度10 μMになるように配合）
• ADP検出ミクスチャー： 1X Stop & Detect Buffer B、8 nM ADP Alexa594 トレーサー、10 μg/mL ADP 2 Antibody-IRDye ® QC-1
• 遊離トレーサー - 1X Stop & Detect Buffer B および 8 nM ADP Alexa594 トレーサー
• バッファーブランク - 1X Stop & Detect Buffer B、10 μg/mL ADP 2 Antibody-IRDye® QC-1

メソッド

1. 各 ATP/ADP 組み合わせを 10 μL ずつ 384 ウェルプレートに分注します。
2. これらの列にADP Detection Mixを10μL加える。
3. 10 μM ATP/0 μM ADPの組み合わせをP列に10 μL分注します。
4. 10μLのFree TracerをウェルP1-P12に分注します。
5. ウェルP13-P24にBuffer Blankを10μL分注します。

標準曲線の作成方法の詳細については、該当する Transcreener® テクニカルマニュアル（https://www.bellbrooklabs.com/technical-resources/technical-manuals/）を参照してください。

マイクロプレートリーダー

• SpectraMax iD3マルチモードマイクロプレートリーダー
• SpectraMax iD5 マルチモードマイクロプレートリーダー
  オプション、SpectraMax iD5リーダー用：
  ⚪︎ホルダー付き蛍光フィルター 565nm BW 30nm（Molecular Devices社、型番6590-0131）
  ⚪︎ホルダー付き蛍光フィルター 625nm BW 35nm（Molecular Devices 社、型番 6590-0108）

SpectraMax iD5 リーダーのモノクロメーターを用いた蛍光検出を、Alexa594 トレーサーに特異的なフィルターペアを用いた検出と比較した。SpectraMax iD3 リーダーは、モノクロメーターのみを使用して蛍光を検出する。

インストゥルメンテーションのセットアップ

SpectraMax iD3/iD5リーダーは、SoftMax® Proデータ収集・解析ソフトウェアを使用します。最適化された設定を使用してプレートを読み取るには、以下の手順に従います：

1. SoftMax Proソフトウェアを開き、Read ModeにFluorescence、Read TypeにEndpointを選択します。
2. Wavelengths（波長）に励起用として575、発光用として620を入力します。フィルターを使用する場合は（SpectraMax iD5 リーダーでのみ使用可 能）、565/30励起フィルターと625/35発光フィルターを取り付け、励起と発光のドロップダウンメニューからこれらのフィルターを選択します。
3. Plate Type と Read Area は、使用するマイクロプレートと読み取るウェルに基づいて選択する。この標準曲線では、マイクロプレートのすべてのウェルを読み取ります。
4. PMT GainをAutomaticに設定し、上方から読み取ります（Read from Bottomにはチェックを入れないでください）。
5. いずれかのリーダーでモノクロメーターを使用する場合は積分時間を50～200msに設定し（積分時間を長くすると、10％変換時のZ'ファクターが向上します）、SpectraMax iD5リーダーでフィルターを使用する場合は50msに設定します。
6. アッセイを最初に設定する際には、マイクロプレートとリードハイトを常に最適化する必要があります。

容量、マイクロプレートのロット、トレーサー、および濃度が同じであれば、同じインストゥルメンテーション設定を後続のプレートの読み取りに使用できます。表 1 に上記の設定をまとめました。

表1. SpectraMax iD3またはiD5リーダーの推奨設定。マイクロプレートとリードハイトは、使用するマイクロプレートの新しいロットまたはアッセイ量ごとに最適化する必要があります（SoftMax Proソフトウェアの機器設定で読み取り前適応化オプションを表示するを使用してください）。SpectraMax iD5リーダーでフィルターを使用する場合、積分時間を50msに設定することで、プレート読み取りに必要な時間を短縮できます。

表2. 異なるリーダー設定でのアッセイ性能。

結論

SpectraMax iD3またはiD5リーダーをセイロFIアッセイに使用した場合のバリデーションを示す。本アプリケーションノートで提案する最適化されたインストゥルメンテーションを使用することで、Z'値 > 0.7が達成可能である。