Application Note SpectraMax iD5およびi3xリーダーでの
Transcreener TR-FRETアッセイ用に最適化された設定

はじめに

ジョイス・イタタニ｜アプリケーションサイエンティスト｜モレキュラー・デバイス
キャシー・オルセン｜Sr.アプリケーションサイエンティスト｜モレキュラー・デバイス

Transcreener® HTSは、何千もの細胞酵素によって形成されるヌクレオチドの検出に基づいた、普遍的でハイスループットの生化学的アッセイプラットフォームであり、その多くは、細胞シグナリングの中心であり、創薬のターゲットとして大きな価値がある共有結合制御反応を触媒する。

Transcreener®TR-FRETアッセイは、遠赤色時間分解Förster共鳴エネルギー移動（TR-FRET）の出力でヌクレオチドを直接検出するシングルステップの競合的イムノアッセイです。すべてのアッセイの試薬は、特異性の高いモノクローナル抗体-テルビウム結合体に結合した遠赤色トレーサーである。テルビウム複合体をUV領域（約330 nm）で励起すると、トレーサーにエネルギーが移動し、より高い波長（665 nm）で発光する。標的酵素によって産生されたヌクレオチド二リン酸または一リン酸は、抗体からトレーサーを置換し、TR-FRETの低下をもたらす（図1）。赤色トレーサーを使用することで、蛍光化合物や光散乱による干渉を最小限に抑えることができる。Transcreener TR-FRETアッセイは、特にハイループットスクリーニング（HTS）用に設計されており、1回添加、混合＆測定形式です。

検証基準

Transcreener HTS アッセイの利点を実現する上で重要な要素は、データ出力に使用する マイクロプレートリーダーの正しいセットアップである。フィルタリングやその他のコンポーネントを含む装置の設定を適切に選択することで、任意のアッセイに対する装置の感度に影響を与えることができる。この種の標準曲線は酵素反応を模倣しているため、10 μM の ATP/ADP 標準曲線（24 レプリケート）を実行することで、Transcreener アッセイ の機器性能に関する主要なパラメータが特定された。10 μM の ATP から開始し、ADP を増量して加え、ATP をそれに比例して減少させ、総アデニンヌクレオチド濃度を 10 μM に維持した。Z'>0.5の条件を決定するために、フラッシュ数を変化させた。ATPの10%変換でZ' > 0.7が達成された場合、インストゥルメンテーションはTranscreener TR-FRETアッセイで使用するためにバリデートされます。

材料 

• Transcreener ADP 2 TR-FRET Red アッセイ (cat. #3011-1K)
• ATP/ADP ミクスチャー： 10 mM MgCl 2、20 mM HEPES、0.01% Brij-35、およびATP/ADP（一定のアデニン濃度10 μMになるように配合）
• ADP検出混合液： 1X Stop and Detect Buffer C、8 nM ADP2 Antibody-Tb Conjugate、26.8 nM ADP HiLyte 647 Tracer
• High FRET ミクスチャー: 8 nM ADP 2 Antibody-Tb Conjugate, 26.8 nM ADP HiLyte 647 Tracer, 1X Stop and Detect Buffer C, 10 μM ATP
• 低FRET混合物：8 nM ADP 2 抗体-Tb コンジュゲート、26.8 nM ADP HiLyte 647 トレーサー、1X 停止および検出バッファーC、10 μM ADP

標準曲線の設定

1. ATP/ADPの組み合わせを10μLずつ、384ウェルプレートの列全体に分注します。
2. ADP Detection Mixtureをそれらの列に10μL加える。
3. 10μM ATP/0 uM ADPの組み合わせをP列に10μL分注します。
4. High FRET MixtureをウェルP1-P12に10μL分注します。
5. ウェルP13-P24にLow FRET Mixtureを10μL分注する。

標準曲線の作成に関するより詳細な手順については、該当するTranscreener Technical Manual (https://www.bellbrooklabs.com/technical-resources/technical-manuals/)をご参照ください。

マイクロプレートリーダー 

• SpectraMax® iD5 マルチモードマイクロプレートリーダー（Molecular Devices cat.#ID5-STD）に以下を搭載：
  ◦改良TRFモジュール（Molecular Devices社カタログ番号0200-7030）
  ◦フィルター320/100（Molecular Devices社より入手可能）
  ◦フィルター616/10（Molecular Devices社カタログ番号6590-0118）
  ◦フィルター665/10（Molecular Devices社カタログ番号6590-0121）
• SpectraMax i3x® マルチモードマイクロプレートリーダー（Molecular Devices社製 cat.#I3X）に以下を搭載：
  ◦HTRF検出カートリッジ（Molecular Devices cat.）

インストゥルメンテーション

SpectraMax iD5およびSpectraMax i3xリーダーは、SoftMax® Proデータ収集・解析ソフトウェアを使用します。最適化された設定を使用して、以下の手順に進みます。

1. SoftMax Proソフトウェアを開き、Read ModeにTR-FRET、Read TypeにEndpointを選択します。SpectraMax i3xリーダーでは、光学的構成としてHTRF（カートリッジ）を選択する。
2. SpectraMax iD5リーダーでは、320/100励起フィルター、616/10および665/10エミッ ションフィルターを装着し、励起およびエミッションの波長メニューからこれらの フィルターを選択します。SpectraMax i3x リーダーでは、HTRF カートリッジを装着し、Optical Configuration として HTRF を選択すると、波長が自動的に選択されます。
3. プレートのタイプと読み取り領域は、使用するマイクロプレートと読み取るウェルに基づいて選択する必要があります。標準曲線では、マイクロプレートのすべてのウェルを読み取ります。
4. PMTとオプションの設定： Flashes per Read（またはPulses per Read）を20～100（ここに示す結果では50を使用）、測定遅延を0.05 ms、積分時間を0.7 msに設定する。
5. マイクロプレートとリードハイトは、新しいロットのマイクロプレートやアッセイ容量を使用するたびに最適化する必要があります。

容量、マイクロプレートのロット、トレーサー、濃度が同じであれば、同じインストゥルメンテーション設定を後続のプレートの読み取りに使用できます。表1に上記の設定をまとめてあります。

結論

SpectraMax iD5 および SpectraMax i3x リーダーを Transcreener ADP2 TR-FRET Red アッセイに使用した場合の検証を行った。最適化された装置設定を用いることで、Z'値＞0.8が達成可能である（表2）。両装置とも、ATP変換率2％以上でバリデーション基準の0.7を超えるZ'値に達し（図2）、ATP変換率10％でZ'が0.7を超えるというバリデーションの最低要件を上回った。