Application Note SPECTRAmax®GEMINIおよびSOFTmax PROを用いた狭ストークスシフト蛍光体の励起
および発光波長の最適化 SPECTRAMAX® Gemini および SOFTmax PRO を使用した場合

はじめに

SpectraMax Gemini マイクロプレート分光蛍光光度計を用いた励起波長と Emission 波長の最適化の基本戦略は、MAXline アプリケーションノート No.30 に概説されています。最も簡単なケースは、フルオロフォアのストークスシフトが比較的大きい場合（> 80 nm）で、最適な波長は、バックグラウンド干渉がないと仮定して、最大シグナルを与える波長です。ストークスシフトが狭い場合、散乱励起光が蛍光シグナルを妨害するため、選択/最適化プロセスは単純ではない。以下のアプリケーションノートでは、ストークスシフトが80 nm未満の蛍光体に対する最適化手順の詳細と、選択プロセスを支援するためのSOFTmax PROのカスタム式を紹介しています。この例で使用されている蛍光体はフルオレセインです。

概要

アプリケーションノートNo.30に記載されているように励起スキャンを行い、励起λmaxを記録する。ストークスシフトが80nm未満の場合、推奨される励起波長はλmaxではありません。その代わりに、励起光のキャリーオーバーは減少するが、十分な蛍光シグナルが残るような、λmaxより低い波長が選択される。最初の反復では、Molecular Devices 社は最大 90% の RFU が得られる可能な限り低い波長を使用することを推奨しています。次に、1つ以上のカットオフフィルターを用いて、エミッションスキャンとバックグラウンドスキャンを行います。シグナル/バックグラウンド対波長のプロットが作成され、可能な限り高いシグナル/バックグラウンド比をもたらす発光波長とカットオフフィルターの組み合わせの選択に役立ちます。

PBS、PH8.5中のフルオレセインを用いた最適化手順の例

励起スキャン

フルオレセイン溶液（PBS中10 nM、pH 8.5）をマイクロプレートウェル（200 µL/ウェル）に4回反復して分注し、PBSのみを他のウェルに分注してブランクとした（以下の考察では「バックグラウンド」と呼ぶ）。文献値に基づいて、Emission Wavelengthを540 nmに初期設定した。カットオフフィルターなしで励起スキャンを行ったところ、488 nmにピークが認められた（図1）。

励起波長の選択

励起／エミッションの分離は明らかに80 nm未満であったため、λmaxより低い波長（482 nm）が選択されました。SOFTmax PROは、λmaxが最良の選択ではないと自動的に判断し、90％の最大RFUを与える最低の励起波長を計算した。詳細な手順とカスタム式を以下に示す。

励起の最適化 "というグループがテンプレートエディターで作成され、フルオレセインサンプルがそれに割り当てられた。図2に示すように、元のグループテーブルを修正し、新しいカラムとサマリーを含むように拡張した。Ex. lambda Maxカラムは、ウェル内の蛍光シグナルが最大となる励起波長を示します。RFU max および 90%MAX RFU 列は自明である。Max.Index列には、最大RFUが発生した開始波長（455 nm）より上の波長の増分が封じ込められ、SOFTmax PROが波長と最大RFU値をリンクさせるために使用します。最後の列（Lambda at 90% Max）には、90%最大RFUに対応する波長が含まれています。

実際の励起波長の選択はグループテーブルの下のサマリー行で行われる。図2の列とサマリーで使用されているカスタム数式を以下の表1に示す（詳細については、SOFTmax PRO数式リファレンスガイドを参照）。S#1の「val」という用語は、エミッション波長をテキストから数値に変換する。最後の要約（S#5）には、波長を選択するための条件式が含まれている。Excitation/Emissionの差が80nm以下であれば、選択される波長はS#3であり、そうでなければS#2である。フルオレセインを用いたこの例では、Excitation/Emissionの波長差が80nm未満であったので、選択された励起波長は482nmであった。

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表1： 励起最適化表の計算式 注：ストークスシフトが極端に狭い蛍光体の場合、90％最大RFUよりもさらに励起波長を短くする必要がある場合があります。

発光スキャン

励起波長として482 nmを選択し、a)カットオフフィルターなし（Emscan1）、b)515 nmカットオフ（Emscan2）、c)530 nmカットオフ（Emscan3）を用いて、エミッションスキャン（500 - 580 nm）を行った。図3に示すように、異なるスキャンを重ね合わせることができるように、All wavelengthsでスキャンを開始することが必須であった(同じ波長で開始しなかった場合、RFU値が波長に対応しないため、プロットに誤りが生じる)。次のセクションでは、SOFTmax PROでスペクトルプロットを重ね合わせる詳細な手順を説明します。

SOFTmax PROカスタム式を使用した、ロースペクトルデータを封じ込めたグループテーブルの作成

図3に示すように、異なるスキャンからのプロットを重ね合わせるために、個々のウェルからの生のスペクトルデータを封じ込めたグループテーブルを作成しました。グループテーブルは人工的なもので、通常のSOFTmax PROの目的であるサンプル情報とウェルの位置をリンクさせるために使用されたものではありません。その代わりに、SOFTmax PROの特別なプレートアクセサーを使用して、異なるプレートやウェルの個々のウェルからの生のスペクトルデータを列に入れました（SOFTmax PROフォーミュラガイドの第4章の「カイネティックおよびスペクトルデータアクセサー」を参照）。この例では、EmOptという名前のグループが作成され、エミッションスキャンプレートの1つのウェルが割り当てられました。(プレートとウェルの位置の選択は重要ではなく、単にグループテーブルを作成するために必要な割り当てでした)。

Wavelengthと呼ばれる列には、Emissionスキャンから読み取られた個々の波長がリストアップされている。これはEmscan2プレートから得られたものである（しかし、どのEmissionスキャンでも可能である）。Sig515という列は、Emscan2プレート（515 nmのカットオフフィルターを使用）のフルオレセインを封じ込めたウェル（F2）の対応するRFU値をリストアップしている。同様に、Bkg515カラムには、同じスキャンのPBS含有ウェル（B1）のRFU値が記載されています。Sig/Bkg515カラムは、各波長における前の2つのカラムの比を示す。他のスキャンの計算式は、プレーティングがカットオフフィルターなしのEmscan1と530nmカットオフフィルターのEmscan3である以外は同様であった。列の作成に使用した計算式の例を表2に示す。

表2： エミッション最適化の計算式（部分リスト）

エミッションプロットの重ね合わせ

波長の列をX変数、Sig515、Sig530、Sig.NoCutoffの列をY変数として、SOFTmax PROのグラフセクションにエミッションプロットを重ね合わせました。予想通り、カットオフフィルターはピークをより長い波長（カットオフフィルターなしの513 nmと比較して、525 nmと539 nm）にシフトさせ、その強度を低下させた（図3）。バックグラウンドスキャンも同様に、Bkg515とBkg530列をY変数として選択し、2番目のグラフセクション（図5）にプロットした。約550 nm以下では、515 nmのカットオフプロットは530 nmのカットオフプロットより明らかに高い。その領域より上では、2つのプロットは基本的に重ね合わせ可能であった。

発光波長とカットオフフィルターの最終選択

シグナル/SB比プロットを作成し、最も高い比率を与える発光波長とカットオフフィルターの組み合わせを特定するのに役立てた。プロットの結果、複数の波長とフィルターの組み合わせが可能であることがわかった（図6）。515 nmのカットオフフィルターでは、ほぼ同等の選択肢が2つあった： 520-525 nmと約550 nmである。530 nmのカットオフフィルターでは、最適な領域は約545 nmであった。このように、いずれかの波長で干渉の可能性があるサンプルに対応するために、いくつかの選択肢が利用可能であった。このような柔軟性は、マルチフルオロフォアアッセイの最適化において非常に有益である。

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