Application Note SpectraMax蛍光マイクロプレートリーダーでの
OxiSelect ORACアッセイ

PDF版（英語）

はじめに

Cathy Olsen, PhD | Sr. Applications Scientist | Molecular Devices

活性酸素種は、通常の細胞プロセス、環境ストレス、紫外線照射によって生成される。これには、ペルオキシラジカル（ROO）、ヒドロキシラジカル（HO）、スーパーオキシドイオン（O2-）、一重項酸素ラジカル（1O2）などが含まれる。酸素ラジカル吸光度（ORAC）測定法は、生理液、食品、飲料、天然物の抗酸化力を評価するために用いられる標準的な方法である。このアッセイでは、細胞の構成成分と反応して損傷を与え、細胞周期に悪影響を及ぼし、癌やその他の病気の原因となる突然変異を引き起こす可能性のあるフリーラジカルを消去する試料の能力を定量的に測定します。

このアプリケーションノートでは、SpectraMax® Gemini™ XPSマイクロプレートリーダーとSoftMax® ProソフトウェアとCell Biolabs OxiSelect™ ORACアッセイを使用して、さまざまなフルーツジュースの抗酸化能を測定し、このアッセイの簡便性を強調します。

アッセイ原理

このアッセイは、酸素ラジカル吸収物質の存在下、2, 2'-アゾビス-2-メチル-プロパニミドアミド二塩酸塩（AAPH）の熱分解から生成したペルオキシルラジカル（ROO.）が蛍光プローブであるフルオレセインのシグナル強度に及ぼす影響に基づいています。吸収能力が強ければ強いほど、ペルオキシルラジカルはクエンチされ、蛍光シグナルの強度は維持される。結果を得るために、蛍光強度対時間の曲線下面積をブランクの面積から差し引き、抗酸化能の標準的尺度として使用されるビタミンE類似体であるTrolox™当量で、存在する物質の抗酸化能を決定する。

材料

アッセイを行うために以下の材料を使用した：

Cell Biolabs OxiSelect ORAC Assay, cat. #STA-345号
SpectraMax Gemini XPS マイクロプレートリーダー
ソリッドブラックGreiner FLUOTRAC™ 200プレート
サンプル：ホワイトクランベリージュース、ホワイトグレープジュース、オレンジジュース、ザクロジュース、クランベリー・ブルーベリージュース、赤ワイン

測定方法

以下に概説するアッセイのセットアップ手順は、キットに付属の Cell Biolabs OxiSelect Oxygen Radical Antioxidant Capacity (ORAC) Activity assay procedure に基づいています。

試薬の調製

フルオレセインプローブの調製：付属の Fluorescein プローブを付属のアッセイ希釈液で 1：100 に希釈した。これを均一性まで混合し、1X Fluorescein solution とした。

アッセイ希釈液の調製：アッセイ希釈液を脱イオン水で 1:4 に希釈し、均一性になるまで混合した。この希釈液をすべての検体と標準液の希釈に使用し、4℃で保存した。

試料の調製：ジュースおよびワインサンプルは、微粒子を除去するため、4℃で10分間、5000～10000 x gで遠心分離した。すべての上清はアッセイを行う前に100倍と1000倍に希釈した。

抗酸化物質標準曲線の作成

1000μMの抗酸化物質標準原液をアッセイ希釈液で希釈し、最終的な所望の濃度になるように標準液を調製した。直ちに使用するために必要な量の抗酸化物質標準液のみを調製した。以下の表1に従って、一連の抗酸化物質標準溶液を調製した。ゼロTrolox標準はブランクとして扱った。

チューブ	トロロックス酸化防止剤標準溶液（μL）	アッセイ希釈液（μL）	トロロックス濃度（μM）
501	50	950	50
2	40	960	40
3	30	970	30
4	20	980	20
5	10	990	10
6	5	955	5
7	2.5	997.5	2.5
8	0	1000	0

表1. 標準物質の調製

注意：各抗酸化物質標準品と試料は、二重測定またはトリプリケートで測定してください。標準曲線は毎回新しく調製したものを使用してください。

結果の計算

ステップ 1. SoftMax® Proソフトウェアを用いて、各試料と標準物質について曲線下面積（AUC）を算出しました。

ステップ2. 各試料および標準品のAUCからブランクAUCを差し引くことにより、正味AUCを算出しました。

ステップ3. 次に、ネットAUC値をy軸にプロットし、x軸にTrolox抗酸化剤標準濃度をプロットした。

ステップ4. 未知試料のμM Trolox等価物（TE）を標準曲線に基づいて計算し、結果を試料1mLあたりのμmol TEとして表した。

結果

標準曲線のグラフ化およびすべてのデータ解析には、SoftMax® Proソフトウェアを使用しました。トロロックス標準物質のカイネティック曲線を図1に示す。ブランクについて曲線下面積（AUC）を算出し、この値を各標準物質から引いて正味AUCを算出した。トロロックス標準物質の正味AUC値を濃度に対してプロットし、図2の標準曲線を得た。

図1. 異なるTrolox濃度のカイネティック曲線。2.5～50μMのトロロックス標準物質の代表的カイネティック曲線を示す。カイネティック曲線は、ORAC値算出の基礎となる曲線下面積（AUC）の算出に用いられる。

図2. トロロックス標準曲線。トロロックス標準曲線は、上記のように各標準物質の正味AUCを計算して作成した（r2 = 0.996）。

すべてのサンプルについて正味AUC値を計算した。トロロックス等価物（TE）として表されるORAC値は、トロロックス標準曲線から逆算され、μmol TE/mLで表される最終ORAC値を得るためにサンプル希釈倍率が掛けられた。1:100で希釈したサンプルは標準曲線の範囲から外れたが、1:1000で希釈したサンプルはすべて範囲内であった。1:1000希釈サンプルのORAC値を表2に示す。

サンプル	ORAC値（μmol TE/mL）
白クランベリージュース	15.7
ホワイトグレープジュース	21.6
オレンジジュース	19.0
ザクロジュース	25.0
クランベリー・ブルーベリージュース	22.8
赤ワイン	29.3

表2. 果汁とワインサンプルのORAC値。

試験したサンプルの中で、赤ワインのORAC値が最も高く、白クランベリージュースのORAC値が最も低かった。異なるメーカーのサンプルを用いて得られた値は、成分が異なる可能性があるため、異なる可能性が高いことに留意されたい。

結論

Cell Biolabs OxiSelect 酸素 ORAC 活性測定は、SpectraMax Gemini XPS マイクロプレートリーダーを使用して簡単に実施できます。標準物質のグラフ化および結果の計算は、リーダーに付属の SoftMax Pro ソフトウェアによって自動的に行われます。

SpectraMax Mシリーズ、i3x、iD3/iD5、Paradigm® マルチモードマイクロプレートリーダー、およびFilterMax™ F5 マルチモードマイクロプレートリーダーはすべて蛍光検出機能を備えており、OxiSelect ORACアッセイにも使用できます。FlexStation® 3 マルチモードマイクロプレートリーダーは、試薬のアッセイプレートへの自動添加のためのオンボードピペッティングも可能です。

参考文献

Huang, D., Ou, B., and Prior, R.L. (2005). The chemistry behind antioxidant capacity assays. J. Agric. Food Chem. 53, 1841-1856.

Wang, H., Cao, G., and Prior, R.L. (1996). 果実の総抗酸化能。J. Agric. Food Chem. 44, 701-705.

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