Application Note SoftMax Pro GxPおよび標準ソフトウェアにおける
平行線分析と相対効力

はじめに

GMP（医薬品の製造管理及び品質管理の基準）及びGLP（試験所の品質管理の基準）の規制の下で運営されている試験室では、生物製剤の分析は平行線分析（PLA）を用いて行われることが多い。PLAは、製品の直接的な測定は行わず、効果を測定する用量反応曲線を比較するために一般的に使用されます（図1）。平行法では、2つの物質に対する生物学的反応が類似しているかどうか、あるいは2つの生物学的環境が同じ物質に対して類似した用量反応曲線を示すかどうかを確認することができる。平行性の検査は、化合物の相対的な効力を計算するための前提条件であり、薬剤比較、分析物確認、交差反応性、妨害物質、マトリックス補正、濃度推定、阻害試験など、多くの医薬品開発アプリケーションにおいて重要な役割を果たします。

2つの曲線は、一方の関数が他方の関数からx軸上で右または左にスケーリングファクターによって得られるとき、平行であると定義される。ƒ(x) = ƒ(rx)、ここでxは投与量、rはスケーリングファクター、または相対効力である1。相対効力は一般に、参照曲線（既知の薬剤）に対して1に設定され、参照曲線を試験曲線（未知の薬剤）に形質転換するために使用されるスケーリングファクターは、未知の薬剤の相対効力である。この方法は、濃度範囲にわたって傾きが変化しない線形回帰カーブフィット処理ではうまくいきます（図2）。しかし、4パラメータや5パラメータロジスティクスのような非線形回帰カーブフィットでは、シグモイド用量反応曲線は濃度範囲全体にわたって変化する傾きを持ちます（図1）。

このアプリケーションノートでは、両手法を説明し、SoftMax® Pro GxPおよびStandardソフトウェアで両手法を使用して並行性をテストする方法を概説します。F検定1,2によるF検定確率とカイ2乗検定3によるカイ2乗確率を用いたプロトコルが実装されています。さらに、フィラーの定理を用いたパラメータ比較法も開発した。このプロトコルはParallelism Testと呼ばれ、SoftMax Pro Protocol LibraryのData Analysisサブフォルダーにあります。これらの手法はすべて、線形回帰曲線と非線形回帰曲線に使用できます。

並列性のテスト

応答比較テスト

生物製剤系はしばしば予想通りにふるまわず、一般にデータにノイズやばらつきが加わる。したがって、正しいカーブフィット処理モデルを選択し、必要であれば、これらの変動に対応できる重み付け係数を適用することが、平行度分析の前に考慮すべき最初の重要なステップです。不適切なカーブフィット処理モデルを選択した場合、平行性の指標に偏りが生じ、誤った結論に至る可能性があります。

平行でない曲線の相対的な力価を計算することは、アッセイデータに対して完全に平行なカーブフィット処理、特に非線形回帰の場合は稀であるため困難です。レスポンス比較法では、試験された曲線を、曲線が平行になるように強制される制約モデルと、曲線が独立してフィット処理される独立モデルに同時にフィットさせる。そして、統計的な測定基準を用いて、非平行に起因すると思われる制約モデルと独立モデルの間の適合度の違いを比較する。

制約モデルにフィットすると、X値を記述するパラメータを除いて、すべてのカーブでカーブを記述するパラメータが同じになります。線形曲線の場合、X値は切片であり、非線形曲線の場合、X値はEC50である上漸近線と下漸近線の中間点です。SoftMax® Proソフトウェアには、線形カーブフィットの相対的な力価を決定するツールだけでなく、制約付きまたはグローバルフィットモデルと相対的な力価推定のための独立モデルの両方を使用して非線形カーブを評価するツールも含まれています。

帰無仮説の検定

レスポンス比較法では、計算された平行度メトリクスは、多くの場合、RSSE（residualsum of squared-errors ）の関数であり、制約モデルがどの程度データに適合するかを決定します。1つの特異性が開発され、Extra-Sum-of-Square分析を使用しています1,2。この統計的回帰手法は、分散分析（ANOVA）の一形態で、帰無仮説は、制約モデルが正しい、または曲線が平行であるというものです。帰無仮説は，F検定によるF検定確率1,2やカイ2乗検定によるカイ2乗確率3など，さまざまな統計手法を用いて検定できる．どちらの方法でも、確率は0と1の間の数値として報告される。確率が1に近づくほど、曲線が平行である可能性が高くなる。F検定の欠陥に注意することが重要である。F-検定は、よくフィットした独立カーブの場合は偽陽性に、フィットの悪い独立カーブの場合は偽陰性になることがある。SoftMax® Proソフトウェアには、この2つの統計手法も含まれています。検定の値と確率は、以下の式で簡単に求めることができる：

• カイ2乗PLA (PlotName@GraphName)： 縮小カーブフィット処理のカイ2乗統計量の値を返す。
• ChiProbabilityPLA (プロット名@グラフセクション)： 縮小カーブフィット処理におけるカイ2乗確率分布の値を返す。
• FStatPLA(PlotName@GraphSection)： 縮小曲線フィット処理のF検定統計量の値を返す。
• FProbPLA(プロット名@グラフセクション)： 縮小曲線フィット処理のF検定確率の値を返す。

注意：上記の数式はすべて、カーブフィット設定ダイアログでグローバルフィット（PLA）オプションが有効になっている場合にのみ使用できます。PlotName@GraphNameは、グラフ名を含むプロットの完全な名前です。例えば、Plot#1@Graph#1やStd@Standardcurveなど。カイ2乗値は指定されたグラフのすべてのプロットから計算されるので、特異性のあるプロットの指定は任意である。

F検定とカイ2乗検定による平行線分析」と題するプロトコルは、これら2つの統計検定法に従って平行線を検定するために開発された。データが取得されるか、プロトコルにインポートされると、計算は自動的に行われ、曲線が平行であるとみなすことができるという帰無仮説が真であるかどうかを評価する。

このプロトコルでは、曲線が平行とみなされるためには、F検定とカイ2乗検定の確率結果が0.05以上でなければならない。大雑把に言うと、この設定では、帰無仮説が真であることの信頼度が95%になります。この信頼水準は、実施したアッセイで許容できる非平行性の水準まで、必要に応じて調整することができます。

ノイズと重み付け

ノイズは測定された反応のランダムな変動として定義されます。ノイズは非平行性の検出能力に影響するため、平行性を評価する際に考慮すべき重要な因子です。ノイズレベルが高くなると、並列性メトリクスはノイズの量よりも少なくなるため、非並列性を測定できなくなります。

F検定とカイ2乗メトリクスの確率計算では、予想されるノイズ・レベルの扱いが異なります。F検定の確率はこの要因に影響されないが、カイ2乗確率はノイズ・レベルに大きく依存し、データの分散が正しく推定されている必要がある。したがって、カイ2乗法を使用するときは、逆分散重み付けが必要です。

アプリケーションノート「SoftMax Pro GxPおよびStandardソフトウェアにおける最適な重み付け係数の選択」で説明したように、バイオアッセイは曲線の上部で分散が大きくなる傾向があります。重みなしの回帰では、平行移動の結果は曲線の上部からのデータポイントによって支配され、応答曲線の下部からの情報はあまり寄与しません。

ソフトウェアのプロトコルでは、使用される重み付け係数は分散の逆数ですが、必要に応じてより適切な重み付け係数に調整することができます。さらに、重みを逆分散として扱うことを指定するオプションもあります（図4G）。パラメータ信頼区間のためのカイ2乗プロファイル法（図4H）は，'Weights are Inverse Variances' ボックスがチェックされているときだけ利用できる．最適な重み係数は、結果が最も変動の大きいデータポイントに支配されないようにします。

SoftMax Pro GxPソフトウェアでPLAを適用する方法

本ソフトウェアでは、ポイントツーポイント、log-logit、キュービックスプラインを除くすべてのグローバルカーブフィット処理でPLAが利用できます。グラフセクションでは、すべてのプロットに同じカーブフィット処理が適用されます。PLAは図4に示すように実装できます。

パラメータ比較法

用量反応曲線の差を直接評価する反応比較法とは異なり、パラメータ比較法は、制約のない曲線のパラメータを近似信頼領域と個別に比較する。パラメータのペアは、指定された信頼度に応じて、この定義された信頼区間内に収まらなければならない。この種の評価は同等性試験と呼ばれ、指定された閾値より小さい平行度をテストする。欧州薬局方で用いられている勾配比法は同等性検定の一例である。

フィラーの定理

Fiellerの定理は、2つのパラメータの比の信頼区間を計算するために統計学を使用します。4 tInv関数は推定比を計算するために使用されるため、確率がpである自由度を持つスチューデントのt分布に従います。SoftMax Proソフトウェアの統計式により、参照曲線とテスト曲線などの2つの曲線間のカーブフィットパラメータの比の信頼区間を計算することができます。確率を0.1（信頼度90%）に設定したこれらの計算を組み込んだプロトコル（図5）が開発されており、必要に応じて調整することができる。基準曲線と試験曲線が平行であると考えられるかどうかを判断するために、計算された信頼区間を、ある信頼水準で定義された固定信頼区間と比較します。プロトコールでは、90%の信頼水準が適用されます。したがって、計算された信頼区間が0.9～1.1以内であれば、曲線は平行であるとみなされます。

線形回帰曲線の場合、このテストはSoftMax ProソフトウェアのBパラメータで記述された参照曲線とテスト曲線の傾き値に適用されます。しかし非線形回帰曲線の場合は、上側漸近線と傾きを記述するパラメータがテストされます。これはFiellerの定理の数学的限界であるため、下側の漸近線はテストされません。低濃度では、パラメータの分散が大きすぎるため、虚数を含む中間計算が生成され、その結果、最終的に計算された信頼区間は正しくないか、計算できない。この問題は、米国農務省（USDA）動物用生物製剤センターにより、下側の漸近線をゼロに固定し、傾きと上側の漸近線を試験に使用するよう勧告されている5。同様に、SoftMax Proソフトウェアに含まれる平行性テストプロトコルは、自動的に下側の漸近線をゼロに設定し、パラメータAまたはパラメータDを上側の漸近線として勾配（パラメータB）をテストし、参照曲線とテスト曲線が平行とみなせるかどうかを判定します（図5）。

結論

多くの生物製剤アッセイでは、用量反応曲線のペア間の平行性判定が必要です。このアプリケーションノートでは、F検定やカイ2乗検定などの反応比較法と、Fiellerの定理を用いたパラメータ比較法について説明します。SoftMax® Proソフトウェアを使用すると、制約付きまたは制約なしのカーブフィット処理モデルのいずれかを選択でき、解析のための高度な統計式が提供されます。このソフトウェアには、各試験用に異なるセクションで作成されたプロトコールもあらかじめ含まれているため、適切な方法を選択して、2つの曲線を記述するパラメータの一部またはすべてについて平行度を簡単に評価することができます。

SoftMax Pro GxPソフトウェアのデータインテグリティ機能とともに、FDA 21 CFR Part 11およびEudraLex Annex 11に準拠したラボで、平行性の評価と相対的な力価の計算を行うことができます。

参考文献

1. Gottschalk, P.D. and Dunn, J.R. 2005. バイオアッセイおよびイムノアッセイデータにおける平行性、直線性、相対力価の測定。Journal of Biopharmaceutical Statistics 15(3)： 437-463.
2. Bates D. M. and Watts D. G. 1988. 非線形回帰分析とその応用．New York, Wiley.
3. Draper, N. R. and Smith H. 1998. 応用回帰分析．第3版．New York, Wiley.
4. Buonaccorsi, J. P. 2005. フィラーの定理。In： Armitage, P., Colton, T., editors. 生物統計学百科事典。2. ニューヨーク、ワイリー。
5. 米国農務省動物用生物製剤センター標準業務方針／手順。2015. 相対的効力を推定するためのソフトウェアの使用。USDA 出版物番号 CVBSOP0102.03. Ames, IA.