Application Note PathCheck®センサー：マイクロプレート分析の強力なツール

  • 1cmキュベットを使用した場合と同様の吸光度値を取得
  • ピペッティングエラーの検出
  • 体積差の補正
  • DNA、タンパク質、NAD(P)Hなどの標準曲線の代わりに消光係数を使用した結果の計算
  • マルチチャンネルリキッドハンドラーの性能検証
  • 希釈することなく、アッセイのダイナミックレンジをより高い吸光度まで広げることができます。
  • アッセイに使用する容量に関係なく結果を標準化
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はじめに

ジョイス・イタタニ｜アプリケーションサイエンティスト｜モレキュラー・デバイス
キャシー・オルセン｜Sr.アプリケーションサイエンティスト｜モレキュラー・デバイス

PathCheck®センサーは、マイクロプレートの各ウェルの液面レベルを測定するSpectraMax®機器の画期的な新技術で、数々の賞を受賞しています2-5。光路長を測定することで、マイクロプレートリーダーと分光光度計の最後の大きな違いをなくします。アクセサリーは不要で、SoftMax® Proソフトウェアが自動的に計算を行います。

マイクロプレートで測定する吸光度とキュベットで測定する吸光度の基本的な違いは、光ビームの構成にあります。キュベットでは、光ビームは水平で、サンプルを通る経路長（通常1cm）はキュベットの壁によって固定されています。マイクロプレートウェル内の光ビームは垂直なので、光路長は液量とメニスカス形成の程度に依存します。光路長の違いはサンプルの見かけの吸光度の違いの原因となり、マイクロプレートとキュベットの結果を比較する際に混乱を招きます。PathCheckセンサー搭載のSpectraMaxマイクロプレート分光光度計は、マイクロプレート内の各サンプルの光路長を迅速かつ簡単に測定できる、マイクロプレートユーザーのための新しく強力なツールを提供します。

図1. キュベット（左）とマイクロプレートウェル（右）を通る光路。

方法

原理

PathCheck®センサーは、近赤外（NIR）スペクトル領域の水の吸光度ピークを使用して光路長を測定します。水の吸光度ピークの高さは、サンプルを通る光路長に比例します（マイクロプレートウェルでは、溶液の体積に比例します）。PathCheck®センサーは、温度の影響を受けない波長で2回のNIR吸光度測定を行います。その後、SoftMax Proソフトウェアが、各ウェルのピークの高さと標準的な1cmキュベットのピークの高さを比較することにより、自動的に経路長を計算します。PathCheckは、水溶液中のほとんどすべての生物製剤分子に適用できます。なぜなら、通常使用される濃度では900 nmから1000 nmの間に吸光度ソリューションがほとんど存在しないからです。PathCheckは、キュベットリファレンスメソッド（ここでは説明しません）を使用することにより、少量の有機物や高濃度のサンプル緩衝液を封じ込めたサンプルにも使用できます。

吸光度測定を1cmの光路長で規格化します：

SoftMax® Proソフトウェアは、1cmの光路長に正規化した吸光度値を自動的にレポートします。以下の表は、75 μL～300μLの黄色試薬で得られた結果を示しています。

光路長と生の吸光度値はウェル容積に正比例しています。1cmの光路長で規格化した後、ウェル内の容量にかかわらず、吸光度値はすべて、同じ溶液を1cmのキュベットで測定して得られた値の1％以内でした。

ウェル体積 経路長(cm)  生吸光度  吸光度/cm   標準偏差/th>   CV% 
0.75uL  0.231  0.090  0.390  0.006  1.6uL 
0.75uL 0.231 0.090 0.390 0.006 1.6
100uL 0.300 0.116 0.387 0.005 1.2
150μL 0.446 0.172 0.385 0.003 0.8
200uL 0.596 0.228 0.383 0.002 0.4
250uL 0.735 0.283 0.384 0.002 0.5
300uL 0.874 0.336 0.384 0.001 0.3

図2. 標準的な1cmキュベットと比較したPathCheckによるマイクロプレートサンプル。

消光ベースのアッセイ：

PathCheckセンサーを使用し、化合物の消光係数を計算因子として入力すると、SoftMax® Proソフトウェアが各ウェル内の濃度を自動的に返します。タンパク質、核酸、NAD(P) Hアッセイは標準曲線なしで実施できます。

ピペッティングエラーの検出

データからエラーの原因を簡単に特定し、取り除くことができます。PathCheck®センサーを使用してSpectraMaxインストゥルメンテーションでプレートを読み取り、グレースケールを使用してデータを表示し、不規則性を強調表示します。以下の例では、12チャンネルのピペッターで、1つのチャンネル（#3）の分注量が2.5%少なくなっています。

図3. PathCheckで補正したデータのグレースケール表示。

色素を添加しないマルチチャンネルピペッターとディスペンサーの性能を検証します：

マイクロプレートにレプリケートで試薬を分注し、PathCheckセンサーを使用してSpectraMaxインストゥルメンテーションで光路長を測定します。SoftMax Proソフトウェアは、行、列、またはプレート全体の標準偏差と変動係数を自動的に報告します（それぞれ12チャンネル、8チャンネル、または96チャンネルのピペッター/ディスペンサーの場合）。また、SoftMax Proソフトウェアは、経路長/分注量の標準曲線から実際の分注量を計算します。分注量は、直接法2,5では最小30μL、差分法3,4では最小4μLまでテストできます。

測定ダイナミックレンジの拡大：

サンプルは希釈することなく、標準キュベットの最大4倍の濃度で測定できます。1cmのキュベットで測定したBSA標準曲線は、マイクロプレート（流路長φ0.25cm）ではφ16mg/mLであるのに対し、φ4mg/mLで直線性から逸脱します。

図4. A) 1～30μLの分注量に対する経路長/分注量の標準曲線。B) PathCheck®センサーを用いたマイクロプレート（100μL/ウェル）で280nmで測定したBSAと、1cmキュベットで測定した同じサンプルとの比較。

PathCheck®センサーのみ：

  • マイクロプレートリーダーで温度に依存しない光路長測定が可能。
  • マイクロプレート内のピペッティングエラーを数秒で特定できます。
  • 容積差を検出することで、マルチチャンネルピペッターや自動リキッドハンドラーの性能を簡単にテストできます。
  • 実際に使用された容量に関係なく、1cmの流路長で標準化された結果を報告できます。
  • 強力なSoftMax Proソフトウェアで自動化されます。

参考文献

  1. R&D誌1998年技術製品トップ100受賞
  2. McGown, E.L. and D.G. Hafeman. Anal. Biochemistry 258, 155-157 (1998)
  3. McGown, E.L. et al. Clinical Chemistry 44(10):2206-8 (1998)
  4. McGown、E.L.ら、Labor Praxis No.5:74-75、1998年5月
  5. アンダース、A.他、労務プラクシス第10号：78-82、1998年10月
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