Application Note 神経活性化合物効果の表現型解析

はじめに

Carole Crittenden｜アプリケーションサイエンティスト｜Molecular Devices社
オクサナ・シレンコ博士｜シニアリサーチサイエンティスト｜Molecular Devices社
カシアノ・カロメウ博士｜研究開発ディレクター｜StemoniX社

iPSC由来の神経3D共培養細胞（StemoniX® microBrain® 3D）は、よりネイティブなヒト皮質脳組織の構造に近いハイスループットスクリーニングプラットフォームとして開発されました。3D神経スフェロイドは、シナプスに富んだ神経ネットワークを封じ込め、自発的、同期的、容易に検出可能なカルシウムオシレーションを示す高機能神経回路を形成する。

ここでは、FLIPR® Pentaハイスループットセルロースクリーニングシステムを用いたカルシウムオシレーションの複雑な解析方法について説明します。ScreenWorks® Peak Pro 2 ソフトウェアは、カルシウムオシレーションレート、ピーク幅と振幅、二次ピークの特徴、波形の不規則性、その他いくつかの読み出しを解析します。さらに、ImageXpress® Microハイコンテントイメージングシステムを用いたハイコンテントイメージングにより、細胞およびミトコンドリア毒性を評価した。

アッセイの特徴付けのために、GABA、NMDA、ドーパミンのような神経伝達物質に影響を及ぼす作用機序が知られている化合物や薬剤を使用した。次に、既知の神経活性薬や発作誘発薬、および環境化学物質の神経毒性プロファイルを評価した。この結果は、神経3D培養を複合事象解析や細胞毒性アッセイと組み合わせることで、医薬品や環境毒物の神経毒性の可能性を評価するための正確で生物学的関連性の高いシステムを形成することを示している。

材料

• StemoniX microBrain 3Dアッセイレディ384ウェルプレート（StemoniX、cat. #BSARX-AA-0384）
• FLIPRカルシウム6アッセイキット（Molecular Devices、カタログ番号R8190）
• FLIPR PentaシステムとScreenWorks Peak Pro 2ソフトウェア（Molecular Devices社製）
• 細胞生存率色素Calcein AM（Invitrogen, cat.）
• ミトコンドリア膜電位色素 MitoTracker Orange（Invitrogen, cat.）
• ヘキスト核色素（Invitrogen、cat. #H3570）
• ImageXpress Micro コンフォーカルシステムとMetaXpress ™ ハイコンテント画像取得・解析ソフトウェア（Molecular Devices社）

方法

3D神経培養の培養と染色

StemoniX microBrain 3D Assay Readyプラットフォームは、よりネイティブなヒト脳組織の組織発生と構成に類似したハイスループット3D培養プラットフォームである。このプラットフォームでは、ヒトiPSC由来の直径約600μmの神経スフェロイドが、図1においてMAP2（緑色）で同定される機能的に活性な皮質グルタミン酸作動性ニューロンおよびGABA作動性ニューロンと、図1においてGFAP（赤色）で同定されるアストロサイトの生理学的に適切な共培養で構成される。このようにバランスよく細胞が混在することで、シナプスに富んだ神経回路網が発達し、高度に機能的な神経回路が形成される。microBrain 3Dスフェロイドの神経細胞は生理的に活発で、自発的に同期し、容易に検出可能なカルシウムオシレーションを示す。

図1. A. ヒトiPSC由来神経スフェロイド。B. 活発な皮質ニューロン（MAP2で識別；緑）とアストロサイト（GFAPで識別；赤）の共培養からなり、直径約600μm。C. カルシウム色素で染色。

StemoniX microBrainプレートは、周囲条件下であらかじめプレーティングされた状態で出荷された。各ウェルには、8～12週成熟した均一な大きさのヒトiPSC由来皮質神経スフェロイドが1個ずつ封入されていた。メーカーの指示に従い、到着日にプレートを200 x gで5分間遠心し、顕微鏡でスフェロイドがプレートウェルの底に沈殿していることを確認した後、70％エタノールで除染し、封を開けた。その後、培地を交換し（1/2量、3回）、プレートを37℃、5％CO2インキュベーターに5-7日間置いた。培地交換は2日おきに行った。

FLIPR Pentaシステムを用いたカルシウムオシレーションパターンの評価

FLIPR Pentaシステムは、高速EMCCDカメラと新しいScreenWorks Peak Pro 2ソフトウェアを搭載している。このシステムにより、ヒトiPSC由来の心筋細胞や神経細胞における複雑なカルシウムオシレーションパターンを測定・解析することができる。
私たちはFLIPR Pentaシステムの新しい高速EMCCDカメラを使用して、FLIPR®カルシウム6アッセイキットを用いて細胞内カルシウムレベルの変化からモニターされる神経スフェロイドのカルシウムオシレーションのカイネティックパターンと周波数を測定しました。システムのScreenWorks Peak Pro 2ピーク解析ソフトウェアモジュールにより、一次および二次ピークと複雑なオシレーションパターンの解析と特性評価が可能になりました。

ニューロンにおける細胞内カルシウム流動は、Sirenko, Grimm et al., 2017に記載されているように、FLIPRカルシウム6アッセイキットを用いて評価した。細胞内カルシウムフラックスのカイネティクスは、FLIPR Pentaシステムを用いて、470-495 nmで10分間、周波数2 Hzで励起した後、515-575 nmで測定した。カメラ感度はNormal、1回の露光時間は0.05秒、読み取り間隔は0.5秒、カメラゲインは6.5、LED励起強度は30％に設定した。インストゥルメンテーションの温度は37℃で一定に保った。カルシウムオシレーションに対する初期の影響は、化合物への最初の曝露後60分で測定した。初期の時点では、化合物添加の2時間前にFLIPR Calcium 6色素を細胞にプレロードした。化合物を添加しない場合のカルシウムオシレーションのベースラインは、化合物添加前に測定した。24時間のカルシウムオシレーションとイメージング実験では、FLIPRカルシウム6色素添加の22時間前に、細胞を適切な濃度の化学物質に曝露した。FLIPRカルシウム6色素（4倍濃度）は、化合物濃度を同じにするため、追加量の化合物とともにさらに2時間添加した。

ImageXpress® Micro Confocalシステムを用いたスフェロイドの形態と生存率の評価

共焦点イメージングと3D画像解析法を用いて、3D神経スフェロイドの形態と生存率に対する化合物の影響を評価した。細胞毒性効果を評価するために、細胞を様々な化合物で24時間処理し、その後、Hoechst核染色、Calcein AM、MitoTracker Orangeミトコンドリア膜電位色素でライブセル染色を行った。画像は、ImageXpress® Micro Confocalシステムを用い、共焦点オプションと3Dイメージングを用いて取得した。

結果

FLIPR Pentaシステムによるカルシウムオシレーションの評価

microBrain 3Dスフェロイドの神経細胞は、自発的に同期したカルシウムオシレーションを起こす。FLIPR Calcium 6 Assay Kitを用いて細胞内カルシウム濃度の変化をモニターしながら、FLIPR Pentaシステムによるカイネティックイメージングで神経スフェロイドのカルシウムオシレーションのパターンと頻度を測定した。NMDA受容体、GABA受容体、AMPA受容体のアゴニストやアンタゴニスト、カイニン酸、抗てんかん薬など、既知の神経調節物質がテストされた。

ImageXpress®マイクロ共焦点システムで経時的に記録したカルシウムオシレーションの画像一式を図2に示す。 定量的データ評価のために、ピークカウント（10分あたり）、平均ピーク振幅、平均CTD 90ピーク幅（オシレーションのピークから90％振幅時）、平均ピーク間隔（ピーク間の時間）、平均ピーク上昇時間（90％振幅から10％振幅まで）、平均ピーク減衰時間（10％振幅から90％振幅まで）、ピーク不規則性などの代表的な記述子を、ScreenWorks Peak Pro 2ソフトウェアを用いて導き出すことができる。この実験では、10分あたりのカルシウムオシレーションカウントとピーク振幅をパラメータとして使用した。オシレーションパターンは様々で、図3に神経伝達物質、図4に神経活性化合物、図5に潜在的神経毒性化合物を示した。代表的なピークカウントとピーク振幅の濃度応答曲線を図6に示す。毒性データとともに、試験したパラメーターを用いて表現型反応パターンを作成することができる。

経時的なカルシウムオシレーション

図2.ImageXpress® Micro Confocalシステムで見た経時的カルシウムオシレーション。

図3. カルシウム感受性色素を用いた神経スフェロイドの細胞内Ca2+オシレーションの速度とパターンに対する様々な神経伝達物質と関連化合物の影響。 細胞はFLIPR Pentaシステムの高速EMCCD蛍光イメージングを用いて、コントロールと比較してテストされた。

図4. 図3と同じ方法で、3種類の神経活性化合物を試験し、オシレーションパターンの速度と振幅における表現型の変化を観察した。

図5. 神経毒性を持つ可能性のある化合物で処理した神経スフェロイドからのカルシウムオシレーションパターン

図6a. いくつかの試験化合物から得られた平均オシレーション振幅に基づく濃度応答曲線。IC50値は以下の通り： AMPA 0.42μM、Muscimol 0.14μM、カイニン酸0.98μM、リドカイン1.9μM。図6b. 試験した他の化合物の10分間の平均オシレーションカウントに基づく濃度応答曲線。IC50値は ハロペリドール2.8μM、GABA11.1μM、リドカイン8.9μM。

ハイコンテントイメージャーによるスフェロイドの生存率と形態の評価

化合物処理後、神経スフェロイドをDAPI、FITC、TRITC 10X Plan Fluor対物レンズで撮像し、共焦点画像のZ-スタック画像（20画像、10μm間隔）を用いて画像化した。最大投影画像をカスタムモジュールエディターとセルスコアリングアルゴリズムを用いて解析し、全細胞、生細胞（カルセインAM陽性細胞）、インタクトなミトコンドリアを有する細胞（ミトトラッカー陽性細胞）の細胞数を検出した。解析方法は、細胞およびスフェロイドの形態を特徴付けるための効率的なツールを提供します。コントロールとクロルプロマジンの結果の一例を図7に示す。

図7. 神経スフェロイドの合成プロジェクション画像。スフェロイドを30μMの標記化合物で24時間処理した後、核染色（Hoechst 33342）、生存率染色（Calcein AM）、ミトコンドリア膜電位染料MitoTracker Orange CMTMRosで2時間染色した（それぞれ2μM、1μM、0.5μM）。

カルシウムオシレーション記述子データとイメージング生存率データを組み合わせることで、microBrain 3Dスフェロイドの神経細胞に対する化合物効果の表現型プロファイルが作成される。化合物タイプ、EC50またはIC50値、ピークハイトまたはピークカウント（該当する場合）に基づき、濃度および生存率によるカルシウムオシレーションの変化の開始により、化合物効果の表現型特性解析の詳細が得られる（表1）。

結論

我々はアッセイ法を開発し、iPSC由来のStemoniX microBrain 3D Assay Ready神経培養プラットフォームをFLIPR Pentaシステムにおける化合物効果の評価に使用することの実現可能性を示した。既知の神経調節薬、神経活性薬、神経毒性薬による機能応答は、ScreenWorks Peak Pro 2解析ソフトウェアを用いて測定されました。カルシウムオシレーションピークパターンとImageXpress® Micro Confocalシステムでの神経毒性の早期検出を組み合わせることで、ハイスループットスクリーニングに有用な表現型プロファイルが作成されました。

詳細はこちら

1. O. Sirenko, C. Carromeu, et al., Functional and Mechanistic Neurotoxicity Profiling Using Human iPSC-Derived Neural 3D Cultures, Toxicological Sciences, Volume 167, Issue 1, January 2019, Pages 58-76.
2. O. Sirenko, FA Grimm, et al., in vitro cardiotoxicity assessment of environmental chemicals using an organotypic human induced pluripotent stem cell-derived model. Toxicology and Applied Pharmacology, Volume 322, 1 May 2017, Pages 60-74.