Application Note ASBC公認ELISA法による
ビール中のグルテンの定量化

キャシー・オルセン博士｜シニアアプリケーションサイエンティスト｜モレキュラーデバイス

ジョイス・イタタニ｜アプリケーション・サイエンティスト｜モレキュラー・デバイス

はじめに

ビール中のグルテンの定量

近年、セリアック病の罹患率が上昇し、グルテンを避けようとする人が増える中、食品や飲料中のグルテン濃度をモニタリングすることの重要性が高まっています。FDAのガイドラインでは、「グルテンフリー」、「グルテンなし」、「グルテンフリー」、「グルテンなし」と表示された食品は、グルテンの含有量が20ppm（100万分の1）未満でなければならないと定められています。これは、現在認められている検査法における定量限界（LOQ）です。

グルテンは、小麦、ライ麦、大麦、およびこれらの穀物の交配種に自然に含まれています。グルテンは、これらの穀物に含まれるプロラミンタンパク質とグルテリンタンパク質の混合物です。食品が加工され、消化される過程で、無傷のプロラミンは小さなペプチド断片に分解され、セリアック患者にとって危険な状態になります。これらの小さなペプチド断片は、サンドイッチ ELISA では 2 つのエピトープが必要なため検出できない。しかし、「RIDASCREEN® Gliadin competitive ELISA」は、小麦、ライ麦、大麦の加水分解物という新しい標準物質を用いて、これらの小さな断片を検出することができます（図1）。本キットで使用する R5 抗体は、小麦由来のグリアジン、ライ麦および大麦由来のプロラミンの潜在的な毒性を持つペプチド配列を認識する（Kahlenberg et al.）

さまざまな種類のサンプル中のグルテン含有量を測定できる製品は数多くあるが、すべてが定量的ではなく、承認された検査法でもない。RIDASCREEN® Gliadin competitive ELISAは、AACCインターナショナル承認試験法（38-55.01）およびAOAC承認分析公定法（First Action OMA 2015.05）であり、ビール、水飴、サワードウでの使用について18のラボによる国際共同試験で評価されています。米国醸造化学者協会（ASBC）による2回目の国際共同研究では、RIDASCREEN®グリアジン競合ELISAが5種類のビールについて15ラボで評価され、このELISAは現在、ASBCの国際公認分析法（Beer-49）となっています。

ここでは、市販されている6種類のビールについて、RIDASCREEN Gliadin competitive ELISAを用いてグルテン濃度を測定した。試験したビールには、グルテンフリー、還元グルテン、ヴァイツェンビール（小麦ビール）、その他の品種が含まれる。ELISA は SpectraMax® ABS Plus マイクロプレートリーダーで読み取り、結果は SoftMax® Pro ソフトウェアを使用して分析した。定量試験の結果、グルテンフリーのビールと還元グルテンのビールで、グルテン濃度が20ppm未満であることが確認された。

資料

• RIDASCREEN Gliadin Competitive（商品番号 R7021）
• 市販ビール
  • 低減グルテン
  • グルテンフリー
  • ヴァイツェンビール
  • ブロンド・エール
  • アメリカン・ポーター
  • インディア・ペールエール
• 冷水魚皮ゼラチン40%（Electron Microscopy Sciences社、カタログ番号25560）
• Multi-Wash+™ マイクロプレートウォッシャー (Molecular Devices社製 cat. #MultiWash+)
• SpectraMax ABS Plus マイクロプレートリーダー（Molecular Devices社製 cat.）

試薬の調製

キットに含まれるすべての試薬は、製品添付文書に記載されている方法で調製しました。

• 緩衝液（サンプル希釈液）は脱イオン水で 1：5 に希釈した。
• 洗浄バッファー は、37℃の水浴で温めて結晶を溶かし、脱イオン水で 1：10 に希釈した。
• 抗体酵素結合体をピペッティング前に振とうし、脱イオン水で1:11に希釈した。アッセイに必要な量のみ希釈した。
• 基質/発色剤（Red Chromogen Pro）および停止液は、すぐに使用できる溶液として供給された。

ビールサンプルの調製

各ビール 1 mL を、10%冷水魚皮ゼラチンを含む 60%エタノール溶液 9 mL と共に 15 mL コニカルチューブに入れた。試料をボルテックスで十分に混合し、ローテーターで10分間回転させた。その後、2500rpmで10分間遠心した。上清はアッセイ用に準備され、密閉容器に入れ、暗所、室温で4週間まで保存可能であった。上清はアッセイ前に希釈サンプル希釈液（バッファー）で1:50に希釈した。

ELISA

ストリップウェル3枚をマイクロウェルストリップホルダーに入れ、未使用のウェルは乾燥剤入りのフォイルパウチに保管した。

各グリアジン標準物質（0、10、30、90、270ng/mL）または調製した試料50μLを重複ウェルに添加した。また、プレートブランクウェル（標準品またはサンプルを添加しない）も作製した。希釈した抗体酵素結合体 50 μL を各ウェルに加え、プレートを軽く振って手動で混合した。プレートを室温で30分間インキュベートした。次に、MultiWash+ Microplate Washerを用い、希釈した洗浄液250 μLでプレートを3回洗浄した。

100μLの基質/発色剤を、プレートブランクウエルを含む各ウエルに添加した。プレートを手動で軽く振って混合し、室温、暗所で10分間インキュベートした。その後、100μLの停止液を各ウェルに添加し、プレートを手動で軽く振り混ぜた。10 分以内に、SpectraMax ABS Plus リーダーで、SoftMax Pro ソフトウェアのプロトコルライブラリにある ELISA プロトコルを用いて 450 nm の吸光度を測定した。

SoftMax Pro ソフトウェアの半対数曲線フィットを用いて標準曲線をプロットし、標準曲線から検体濃度を算出した。

結果

グリアジン標準曲線（図2）から、グリアジン濃度がソフトウェアによって自動的に補間された。濃度(ng/mL)は、希釈倍率(500)をかけて元のビール試料に含まれる値に調整し、グリアジン(ng/mL)は1000で割ってグリアジン(ppm)に変換した。グリアジンをグルテンに変換するには、2倍の係数を使用し（Codex Alimentariusの定義）、結果は最終的にグルテンppmで表された（図3）。これらの計算は、SoftMax Proソフトウェアのプロトコルの「未知試料」グループ表に追加した。

R - 標準範囲外 図3. SoftMax Proソフトウェアで見たグループ表。ビール試料中のグリアジン濃度は標準曲線から補間し、希釈倍率を乗じて調整濃度（ng/mL）とした。調整濃度からグリアジンppmとグルテンppmを算出した。

還元グルテンまたはグルテンフリーのラベルが貼られたビールは、グルテン濃度の計算値が20ppm未満で、これらのラベルに関するFDAのガイドラインに適合していました。グルテンフリーのビールサンプルのうち1つの複製では、OD値がグリアジン標準物質の最低値を下回ったため、この複製はグループテーブルで範囲外、「R」のフラグが付けられました（図3）。ヴァイツェンビールはグルテン含量が高いと予想されたが、実際に270 ng/mLの標準物質を超えるグリアジン値を示し、グループ表でも範囲外のフラグが立てられた。グルテンを正確に定量するには、このビールをさらに希釈する必要がある。他の全てのビールは14～118ppmのグルテンで、インディア・ペールエールは20ppmの「グルテンフリー」レベルを下回った。

ブロンドエールは87ppmのグルテンで、コーデックス規格では「超低グルテン」と表示される可能性がある。

SpectraMaxマルチモードリーダーでも同様の結果が得られた（結果は図示せず）。

結論

RIDASCREEN Gliadin competitive ELISA は、ビール中のグルテンを定量的に検出するソリューションを提供する。MultiWash+ 洗浄機を使用して洗浄ステップを自動化することで、このアッセイの実施に必要な作業時間が短縮される。SpectraMax ABS Plusリーダーで吸光度を検出し、SoftMax Proソフトウェアのプロトコルを使用して結果を計算することで、ELISAワークフローがさらに簡素化され、さらに注意が必要な結果にフラグを立てることができます。サンプルから結果まで、グルテン含量を確実に測定するために必要な時間はわずか1時間程度です。

参考文献

Kahlenberg F., Sanchez D., Lachmann I., Tuckova L., Tlaskalova H., Mendez E., Mothes T. (2005). モノクローナル抗体R5によるセリアック病毒性グリアジンペプチドの検出。European Food Research and Technology 222(1-2), 78-82.