Application Note 非Abタンパク質を分泌する高産生な哺乳動物細胞を
迅速かつ効率的に選択する
- 最適な生産者と細胞を選択する確率を高める
- 細胞株／抗体開発時間の短縮-限界希釈法の回避
- in situでの発現レベルに基づき、成績不良の細胞を早い段階で排除
- ロボットを再設計することで、コロニー攪乱のリスクを低減しながら、正確で信頼性の高いコロニーをピッキングする。
PDF版（英語）
はじめに
ClonePix®システムの技術は、治療用タンパク質の高産生・分泌細胞のコロニーセレクションを可能にします。単量体の治療用タンパク質を分泌するトランスフェクトCHO細胞やHEK293細胞のコロニーセレクションは、特定のタンパク質に特異的に蛍光標識した抗体、蛍光イメージングのほか、ロボットを使用した処理とピッキング技術を用いることで、ワークフローの効率と合理性を大幅に向上させ、目的のタンパク質を最高レベルで分泌する最適な細胞株を作製します。
ClonePix®システムの技術は、治療用タンパク質の高産生・分泌細胞のコロニーセレクションを可能にします。単量体の治療用タンパク質を分泌するトランスフェクトCHO細胞やHEK293細胞のコロニーセレクションは、特定のタンパク質に特異的に蛍光標識した抗体、蛍光イメージングのほか、ロボットを使用した処理とピッキング技術を用いることで、ワークフローの効率と合理性を大幅に向上させ、目的のタンパク質を最高レベルで分泌する最適な細胞株を作製します。
ClonePix®システムは、連続希釈やセルソーティング技術を不要にします。高産生な細胞のモノクローナル集団は、はるかに短い時間枠で樹立され、生産者の細胞株最適化やタンパク質生産のための下流のスケールアップに関連するボトルネックの多くを取り除く。
図1. HEK 293細胞の高分泌コロニー。目的のタグなし単量体タンパク質を安定的にトランスフェクトし、CloneMatrixベースの半固形培地下で培養したHEK 293細胞の高分泌コロニー（青丸）の検出；そのタンパク質に対するFITC結合ポリクローナル抗体でイメージング。画像は、最も生産性の高いコロニーの周囲に分泌タンパク質の雲を伴う、緑色に着色された生産細胞／コロニーを示す。
タグ融合組換えタンパク質を産生する細胞の検出とピッキング
目的のタンパク質を直接検出できない場合（特異性抗体が入手できない場合など）、タグに対する蛍光結合抗体でプローブすることにより、タグ融合組換えタンパク質を間接的に検出することができる。例えば、図2に示すように、 タンパク質のC末端にHis6-およびFLAG-タグ配列を持つ 目的のタンパク質をコードする構築物を、好みの細胞株 （CHO、HEK、NS0など）にトランスフェクトし、抗His 抗体および抗FLAG抗体の混合抗体（少なくとも一方は蛍光 標識しておく）を用いて検出することができる。タグが十分に大きい場合（例えば2x FlagやヒトFcタグ）、検出プローブは1つで十分である。
図2. タグ融合組換えタンパク質の検出原理。タグ融合組換えタンパク質を検出するClonePix® システムの技術原理。分泌されたタグ付きタンパク質はコロニー近傍に捕捉され、蛍光標識抗タグ抗体を用いて可視化される。
図3. 付着CHOコロニーの白色光と蛍光イメージ。接着したCHOコロニーの白色光（A）と蛍光イメージ（B）。CHO細胞は、C'末端にHis6とFLAGエピトープの両方を封入した単量体タンパク質構築物で安定的にトランスフェクトした。CloneMatrixベースの半固形培地中で懸濁液として増殖させた。His6とFLAGに対する抗体でイメージャーし、このうち抗His6抗体は分泌タンパク質の蛍光可視化を可能にするためにFITCと結合させた。
これにより、タグなしタンパク質の場合とまったく同じ方法でタンパク質の分泌を分析したり（上記）、IgG分泌実験や、その後の高生産者コロニーをピッキングし、ピッキング後にモノクローナル高産生な集団に成長させることができる。
方法
目的のタンパク質をコードする構築物（必要であれば2つのエピトープタグを付加したもの）を細胞株にトランスフェクションした後、細胞を標準的な方法で選択下で増殖させ、CloneMatrix（K8500）と2倍濃縮培地を用いて、半固形培地1mL当たり200（CHO）～1000（HEK293）個の細胞密度でプレーティングする。血清封じ込め培地および化学的に定義された発現培地のいずれも使用可能である。
目的のタンパク質に対するポリクローナル抗体（蛍光コンジュゲート）、または使用するエピトープタグに対する2種類の抗体を、プレーティング時に培地に添加するか、または少なくとも24時間前にアトマイザーを用いてスプレーし、コロニーをイメージングしてピッキングする。いずれの場合も、最終抗体濃度は7～10μg/mLであるべきである。特定の抗体を低濃度に滴定したり、画像強度を向上させるために抗体濃度を高めたりすることは可能かもしれないが、上記のデータではこれらの濃度が最適であることが証明されている。エピトープタグを使用する場合、両抗体のモル量は1:1 の比率にし、両方でなくとも少なくとも一方は選択した蛍光色素に結合させる。
セルは接着コロニー（培地をTC処理したプレーティングプレートにプレー トする）または懸濁コロニーとして増殖させることができる。可能な限り、生産者細胞を浮遊コロニーとして増殖させる方が、画質とピッキング効率が向上するため、常に望ましい。CHO-K1やHEK-293のような典型的な接着細胞であっても、半固形培地中では懸濁コロニーとして増殖させることができる。
半固形培地に懸濁または接着した約 100 個の細胞のコロニーに成長した後（通常 7～12 日後）、ClonePix を使用してプレートを蛍光イメージャーすることができます。その後、システム・ソフトウエアが自動的に蛍光強度（したがって生産性）を解析し、最も分泌量の多いコロニーを、アウトグロースとスケールアップのために選択した発現培地を封じ込めた96ウェルのデスティネーションプレート内の別々のウェルにピッキングする。ピッキングされた細胞株は、クローン性高産生細胞株となる。
結論
ClonePix®システムの技術は、連続希釈や細胞選別技術の必要性を排除します。これにより、高産生な細胞のモノクローナル集団をはるかに短期間で樹立することができ、生産者の細胞株最適化やタンパク質生産のための下流のスケールアップに関連するボトルネックの多くを取り除くことができる。必要な労働力が少ないということは、より多くのセル集団を並行して調べることができ、セルラインのスループットが向上することを意味する。人の科学者が1台のClonePix® システムを使用すれば、トランスフェクションからシェイクフラスコステージまで、年間100以上の細胞集団を処理するのに十分であると見積もられています。
PDF版（英語）