Application Note 細胞表面タンパク質発現による
哺乳類細胞コロニーの迅速な自動セレクション
- 最適な生産者と細胞を選択する確率を高める
- 細胞株／抗体の開発時間を短縮-限界希釈法を避ける。
- in situでの発現レベルに基づき、成績不良の細胞を早い段階で排除
- ロボットを再設計することで、コロニー攪乱のリスクを低減しながら、正確で信頼性の高いコロニーをピッキングする。
PDF版（英語）
はじめに
当社独自のClonePix 2システム技術は、哺乳類細胞を半固形培地に浮遊させたクローン性コロニーに増殖させ、蛍光アッセイやマーカーを用いてこれらのコロニーをイメージングする能力を利用したものである。ここでは、細胞表面タンパク質の発現に基づくクローン細胞集団の分離という、この技術の新しい応用について述べる。
表面タンパク質の発現に基づいて細胞を選択する能力は、下流の表現型／ジェノタイピング、基礎探索研究、あるいは細胞ベースアッセイやスクリーニングのための細胞株として、目的の受容体を発現する細胞株を樹立する際に大いに役立つ。歴史的に、このような細胞の分離は、蛍光活性化フローサイトメトリー（FACS）を用いて、細胞ベースのタンパク質発現を選別することで達成されてきた。当社の蛍光イメージング技術を用いることで、特定のレセプターまたはレセプター/細胞表面タンパク質の組み合わせに対して高発現な細胞を選択することができるフローサイトメトリーに代わる高出力な方法を提供することができました。
内因性発現表面タンパク質の選択
私たちは半固形培地を最適化し、様々なセルを14日以内に50-100細胞の浮遊クローンコロニーに増殖できるようにした。これにより、目的のタンパク質に蛍光結合させた抗体を用いて、内因性細胞表面タンパク質の発現について、混合性あるいは不均一性の集団から細胞を選択することが可能になった（図1）。
図1. 内因性レセプターを発現する細胞のコロニー。内在性レセプターを発現している細胞のコロニーの検出とセレクション（赤丸で示したコロニーのセレクション例）；ClonePix®システムによるカラー化画像： A) T細胞受容体CD3に対するRedPhycoerythrin（RPE）標識抗体を12日目に添加し、14日目に細胞を画像化しピッキングした半固形培地で培養したJurkat細胞。B) ICAM-1接着分子に対するFITC標識抗体を12日目に添加し、半固形培地で培養したHEK 293細胞。C) 多能性マーカーSSEA-1に対するRPE標識抗体を9日目に添加し、半固形培地で培養したCGR8マウス胚性幹細胞。
トランスフェクトされた外来性細胞表面タンパク質のセレクション
この技術は、目的のレセプターをトランスフェクションした細胞株の選択にも拡張されている。このレセプターに対する抗体を用いることで、ClonePix 2システム技術は、蛍光強度、ひいてはレセプター発現レベルに基づいて、一過性または安定的トランスフェクタントの集団から高発現コロニーを選択することを可能にする。これは、スクリーニング用のレポーター細胞株を作製する際に非常に重要である（図2）。
図2. CHO K-1細胞のコロニー検出とセレクション。ヒトGタンパク質共役型プリン作動性受容体P2Y1をコードする構築物を安定的にトランスフェクトしたCHO K-1細胞のコロニーの検出とセレクション。細胞を半固形培地で培養し、8日目にプリン作動性受容体hP2Y1に対するFMAT-Blue（Applied Biosystems）標識ポリクローナル抗体を添加し、9日目に細胞を画像化してピッキングした。画像は、ClonePix®システム（Cy5フィルターセット、4s）によるピッキング前（A）とピッキング後（B）のカラー化画像で、培地から最も明るいコロニーが除去されていることが明瞭に示されている。C)P2Y1依存性蛍光がコロニー内の細胞と密接に関連していることを示す単一コロニーの高解像度画像。
エピトープタグ付きレセプターを用いたセレクション
新規レセプターや創薬ターゲットの創薬研究において、目的の新規レセプターに対する抗体を作製または取得できない場合がある。このため、私たちは、トランスフェクトされたレセプターに細胞外エピトープタグがコードされたコンストラクトを発現する細胞のコロニーをピッキングする技術を検証しました。発現は、エピトープタグに蛍光結合した抗体を用いて検出し、定量化する。FLAGタグ付きトランスフェクト受容体を用いたこのような実験の例を図3に示す。
図3. FLAGタグ付き細胞のコロニー検出とセレクション。FLAGタグ付きヒト創薬標的レセプターを安定的にトランスフェクトしたCHO K-1細胞のコロニーの検出とセレクション。細胞を半固形培地で培養し、8日目にFITC標識抗FLAGモノクローナル抗体を添加し、10日目に細胞をイメージングしてピッキングした。画像は、ClonePix FL（FITCフィルターセット、5s）によるピッキング前（A）とピッキング後（B）のコロニー画像で、培地からコロニーが除去されている様子がはっきりとわかる。
方法
本出願の上記の各実施例において、シングルセルをCloneMatrix（Molecular Devices、Cat #K8510）ベースの半固形培地（調査中の各細胞株に適切な液体培地ベースを使用）に300～1000個/mL（細胞株によって異なる）の密度でプレーティングした。この細胞懸濁液2mLを黒壁ペトリ ウエル-6プレート（Molecular Devices、Cat #W1150）の各ウェルにプレーティングし、細胞を37℃に戻し、コロニーあたり50～100個のコロニーに増殖させた（細胞株によって異なるが、7～14日間）。コロニーがこの最適なサイズに達した時点で、目的のレセプターに対応する蛍光抗体を、当社のアトマイザーボトルを用いて半固形培地に噴霧し、ウェル上に抗体溶液が均一に行き渡るようにした。抗体を培地中に拡散させ、目的のレセプターを 発現しているコロニーに結合させるため、プレートをさらに 24～48時間インキュベートした。
蛍光コロニーは、ClonePix® 2システムを用い、使用する蛍光色素用の励起/発光フィルターセットを用いてイメージングした。これらの画像をシステムの専用ソフトウェアで解析し、コロニーを半固形培地からピッキングし（システムの標準ピッキング手順を使用）、蛍光の強い順に96ウェルデスティネーションプレート（適切な増殖培地200μLを封入）のウェルに分注した（すなわち、最も蛍光の強いコロニーをウェルA1に）。
ピッキングした細胞のクローン集団は、ピッキング後に分析し、ピッキング後の良好な増殖と生存率を確認した。
結論
半固形培地中でのクローンコロニーの増殖と蛍光スクリーニングにより、ClonePix 2システム技術は、表面タンパク質発現に基づくコロニー細胞株のセレクション効率を向上させることで、時間と人件費を大幅に削減することができます。自動分析・ピッキングの前に細胞のコロニーを増殖させるという当社の斬新な方法により、「ソート」された細胞の生存率がはるかに高くなり、3000以上のクローンから目的のコロニーを同定することができる。当社の確立された技術のこの応用は、細胞株開発の質と効率を大幅に向上させる。
抗体試薬
このアプリケーションをサポートするため、モレキュラー・デバイスは、さまざまなヒト細胞表面タンパク質に対する蛍光標識抗体の広範なパネルを開発し、そのすべてに独自のアトマイザーボトルが付属しているため、半固形培地に簡単かつ容易に塗布することができます。
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