Application Note 新規ClonePix技術を用いた
GPCR発現哺乳類細胞株の迅速な選択と開発

背景

ClonePix™ 2システムは、哺乳類細胞株におけるGPCR標的タンパク質の発現レベルを迅速に評価する新しい方法を提供します。

哺乳動物細胞におけるGPCRの内因性発現は一般的に非常に低く、細胞あたり3,000コピー以下である。このような内因性発現レベルは、受容体の機能を適切に維持するには十分であるが、GPCR創薬努力に関しては難題となる。ほとんどのスクリーニングアッセイでは、細胞表面に提示される機能的GPCRの濃度がはるかに高いことが要求される。例えば、構造研究、低分子薬物設計、ネイティブGPCR標的に対する機能的抗体の作製には、内因性レベルより桁違いに高い発現レベルが必要である。低分子 "生物で発現系を作ろうとする試みは、非効率的なフォールディング（バクテリア）、低収量（酵母）、誤った翻訳後修飾（バキュロウイルス）などのために、限られた成功しか収めていない。このような課題から、創薬に必要なGPCRタンパク質の発現レベルを高めることができる哺乳類発現系に対する市場ニーズが高まっている。

トランスフェクトされた細胞プールから高発現GPCRクローンを発見・選択することは、細胞株開発に関して困難な場合があります。ClonePix 2システムの技術は、大規模な不均一性細胞集団を迅速に（3週間で10,000クローン）スクリーニングする実証済みのワンステップ・メソッドであり、分析可能な細胞プールが大幅に増えるため、最適な生産者を見つける確率が高まります。白色光と蛍光イメージの両方をin situで利用するClonePix 2システムは、細胞表面発現に限定された内因性タンパク質レベルを検出する感度を備えています。

方法

クローンピックス2システムによる細胞表面発現タンパク質の検出の可能性を実証するために、内因性Gタンパク質共役型ムスカリン1コリン作動性受容体（GPCR - M1）を発現するトランスフェクトCHO-M1細胞株が選ばれた。CHO-M1発現クローンを、PE（フィコエリトリン）を結合させた抗M1抗体を用いてスクリーニングし、蛍光強度に基づいて選択し、ClonePix 2システムを用いてピッキングした。陰性対照として親細胞株CHO-K1（野生型）を用いた。ClonePix 2システムでピッキングしたコロニーは、細胞増殖を客観的に評価するための標識不要システムであるCloneSelect™ Imaagerで増殖をモニターした。ClonePix 2システムを用いて単離したクローンの機能検証は、Molecular Devices社のFLIPR® Tetra HighTroughput Cellular Screening SystemとFLIPR® Calcium 6 Assay Kitsを用いて行った。FLIPR Tetraシステムはハイスループットで細胞ベースの機能的アッセイを行い、蛍光カルシウム感受性レポーター色素の使用により検出されるGPCR活性化後の細胞内カルシウム応答の変化を評価する創薬で選択されるシステムである。

材料

• セルライン 内因性Gタンパク質共役型ムスカリン性アセチルコリン受容体M1（M1 WT3）を発現するCHO-M1細胞株（ATCC、Cat.#CRL1985）。ネガティブコントロールとして親細胞CHO-K1を使用。
• 抗体： ウサギ抗ChRM1- PE標識、ポリクローナル（Bioss、Cat. #ABIN668656）；ウサギ抗CHRM1ポリクローナルAbs、ノンジュゲート（Bioss、Cat. #bs-1150R）；ヤギ抗ウサギIgG- PE標識、ポリクローナル（Life Technologies、Cat. #P2771MP）。
• 培地： ハムF12培地（Corning、Cat. #10-080-CV）；CloneMedia-CHO-S（Molecular Devices、Cat. #K8710）；ウシ胎児血清（Hyclone、Cat. #SH30071.03）、1% Pen/Strep/グルタミン（Life Technologies、Cat. #10378016）、450μg/mL Geneticin、G418（Life Technologies、Cat. #10131035）。
• アッセイバッファー： 10X HBSS（Life Technologies、Cat. #14065056）を注射用滅菌水（Irvine Scientific、Cat. #9309）で希釈し、20mM HEPES（Life Technologies、Cat. #15630080）を加える。pHを7.4に調整する。
• FLIPR® Calcium 6 Assay Kits（Molecular Devices、カタログ番号R8190）。
• プレーティング： 6ウェル非TC処理透明底プレート（Greiner Bio-One、Cat. #657185）；96ウェル透明F底プレート（Greiner Bio-One、Cat. #655185）；384ウェル黒壁無菌TC処理透明底プレート（Corning、Cat. #3072）。
• M1 AChRアゴニスト： 塩化カルバモイルコリンまたはカルバコール（Sigma、Cat.）
• 浮遊細胞株、接着細胞株ともに、以下のような複数のアプリケーションに対応：
  ⚪︎目的の抗体を分泌するハイブリドーマのスクリーニングと選択
  ⚪︎細胞株開発

クローンセレクト イメージャー

• 細胞のラベルフリー白色光イメージング
• 細胞増殖の対物レンズによる定量評価
• シンプルでユーザーフレンドリーなソフトウェアインターフェース
• 96ウェルプレートの各ウェルにおける成長速度を正確に測定
• 以下のような複数のアプリケーションをサポート
  ◦細胞増殖のモニタリング
  ◦モノクローナリティの検証

FLIPR テトラシステム

• 標準EMCCD蛍光またはオプションのICCD蛍光および発光検出
• ユーザー設定可能な96、384、1536ウェルピペッター
• ユーザー交換可能なセル懸濁液オプション
• ユニークで設定可能な励起光学系による色素能力の拡張
• 直感的でユーザーフレンドリーなソフトウェアインターフェース
• TetraCycler内部プレートハンドラー、ロボットによるスループット向上

半固形培地での細胞のプレーティング

CHO-M1とCHO-K1細胞株： CHO-M1細胞と親CHO-K1細胞の両方を、CloneMedia CHOにウェル当たり1,000細胞の最終密度でプレーティングし、分離が明瞭なコロニーが形成されるまで37℃で8～10日間インキュベートした。CHO-M1細胞の新しい継代と古い継代の両方をプレーティングし、様々なレベルのM1 GPCR発現を調べた。

直接標識法： PEで標識したムスカリン1受容体（CHRM1）に対する抗体を、細胞と共に半固形培地に直接添加した。抗体を含まない細胞を封じ込めたコントロールウェルもプレーティングした。

二重標識法： 直接標識された抗体が使用できない場合、一次抗体と二次抗体の使用可能性をテストした。非標識ウサギ抗ムスカリン抗体とPE標識抗ウサギポリクローナル抗体の両方を、細胞とともに半固形培地に直接添加した。抗体無添加の細胞を封じ込めたウェルと、二次抗体のみを封じ込めたウェルもプレーティングした。

装置概要 ClonePix 2システム

• 哺乳類クローンスクリーニング自動化システム
• 白色光と蛍光によるイメージング
• 透過照明により、接着単層膜などの低コントラストコロニーのイメージングをサポート
• 最大5組の励起／エミッションフィルターをソフトウェア制御で切り替え可能
• ユーザー定義可能な基準でコロニーをランク付け
• ターゲットコロニーを同定し、96ウェルデスティネーションプレートにピッキング

ClonePix 2システムを用いたGPCR（M1）発現クローンのイメージングとピッキング

ClonePix®2システムを用いて、陽性細胞（CHO-M1）と陰性細胞（CHO-K1）の両方をイメージングし、ピッキングした。セルは、各コロニーの位置と形態を同定するために明視野でイメージングされ、M1の高発現者を同定するために蛍光イメージでイメージングされた。PE標識プローブにはCy5チャンネルを用い、露光時間は6,000 msとした。

CHO-M1陽性細胞は、ClonePix® 2システム上で、直接標識抗体とdualantibodyアプローチの両方で、さまざまな蛍光シグナルを示した。これはM1 GPCRの様々な発現レベルに対応している（図1）。予想通り、親株CHO-K1は蛍光シグナルを発しなかった。

形態と蛍光強度に基づいてコロニーを同定・分離するため、セルをグループ分けした。ピッキングされたコロニーの許容される形態は、サイズ、形状、隣接するコロニーとの近接性に基づいた。形態学的に理想的なコロニーは、内部の蛍光強度によってランク付けされ、4つの蛍光グループ（高輝度、中程度、CHO-K1 neg、Ungated）のいずれかに分類された（図2）。CHO-K1 negグループはバックグラウンドシグナルの強さで定義した。このグループで同定されたコロニーはすべて、対応する陰性対照ウェルに由来することが確認された。Ungated コロニーとは、シグナルレベルは低いがバックグラウンド以上のコロニーを指す。

直接標識抗体と2抗体アプローチ（Fig. 3）のいずれも、陽性サンプル（M1発現）では蛍光シグナルを示し、親細胞株ではシグナルを示さなかった（Fig.） 予想されたように、二重標識アプローチでは、バックグラウンドで一次抗体と二次抗体が結合するため、PEチャンネルでより多くのバックグラウンドシグナルが生じた。しかし、ClonePix 2システムは明視野でコロニーを検出し、コロニー内の蛍光シグナルを探す。したがって、ClonePix 2システムには、バックグラウンドシグナルから真のコロニーを識別できるという利点があります。

ClonePix 2システムでピッキングしたコロニーを、CHO-M1クローンでは200 µLのHam's F12培地+10%FBS+G418を、CHO-K1クローンではG418を含まない同じ培地条件の96ウェルプレートに移植した。これらの 96 ウェルプレートを CloneSelect Imager で画像化し、移植と増殖を確認した（図 5）。細胞を 1 週間培養した後、CloneSelect Imager で分析し、細胞が増殖したことを確認した（図 5 および 6）。続いてセルを 384 ウェルプレートに移し、FLIPR Tetra システムで FLIPR Calcium 6 アッセイを用いて発現の機能検証を行った。

FLIPR Tetraシステムによるピッキング細胞でのM1 GPCR発現の検証

セルの準備

ClonePix 2システムで選別したセルを、384ウェルプレートに、1ウェル当たり25μLの増殖培地当たり5,000細胞で一晩プレーティングし、湿度95%、CO2 5%の条件下、37℃でインキュベートした。これらのセルを、ClonePix®システム技術に基づき、M1発現が高、中、低、無の4つのグループに分類した。

カルシウム感受性蛍光色素負荷

セルプレートをインキュベーターから取り出し、室温に平衡化した後、色素を添加した。培地を除去することなく、FLIPR Calcium 6 Dye 25 µLをセルプレートに添加した。このプレートを2.5 mMプロベネシド中で37℃、2時間インキュベートし、有機アニオントランスポーターをブロックした後、蛍光を読み取るまで室温に保った。

FLIPR テトラ蛍光イメージングプレートリーダー

インキュベーションと室温への平衡化後、1枚のプレートをFLIPR Tetraシステムのプレートリーダープラットフォームに置いた。蛍光カルシウムシグナルは、ICCDカメラで以下のパラメータで撮影した：

• 露出（秒）： 0.53
• 励起LED (nm)： 470-495
• 発光フィルター (nm)： 515-575
• LED強度：80

FLIPRカルシウム6測定法

蛍光測定は1秒に1回行い、40nMのカルバコール添加前と添加後にそれぞれ10回と60回の測定を行った。開始カルバコール濃度は最終濃度の5倍に設定した。カルバコール添加量は12.5 µLで、20 µL/秒で分注した。

FLIPRカルシウム6アッセイキットを用いたピッキングしたCHO-M1およびCHO-K1クローンのバリデーション

膜結合型Gタンパク質共役型ムスカリン受容体の発現レベルを、新しい継代と古い継代のCHO-M1細胞からPEを結合させた抗M1抗体を用いて評価した。古い継代細胞では、M1 GPCRの発現レベルは新しい継代細胞よりも有意に低くなると予想される。陰性対照として、親細胞であるCHO-K1細胞も用いた。

リガンドによってGPCRが活性化されると、受容体の構造が変化し、細胞内でGタンパク質が活性化される。活性化されたGタンパク質は、カルシウムを含む細胞内メッセンジャーの様々なカスケードを誘導する可能性がある。

ClonePix®2システムでピッキングした各群のセルについて、FLIPR Tetraシステムを用いて機能活性を評価した。カルシウム感受性蛍光色素（FLIPR Calcium 6 Assay Kit）を用いて、本実験を通してカルバコール40 nMによるGタンパク質共役型IP3感受性経路の活性化を介した細胞質カルシウムの変化を評価した。40nMのカルバコールは、経験的に決定された過去のアゴニスト濃度応答曲線に基づくEC80濃度である。

CHO-M1の高蛍光ピッキングされたクローンでは、カルバコールはバックグラウンドからの蛍光読み取り値を4倍に増加させた（図7A）。CHO-M1中型および低蛍光ピッキング混合クローンでは、カルバコールはバックグラウンドからの蛍光測定値をそれぞれ4倍および2倍に増加させた（図7B）。最後にCHO-K1陰性群では、カルバコールはバックグラウンドからの蛍光読み取りの有意な変化を引き起こせなかった（図7C）。中程度の蛍光強度と低い蛍光強度の混合ピッキング クローンを除く各グループは、別々の 384 ウエルプレートに播種したため、ベースライン 蛍光強度の変化は、40 nM カルバコール添加前の各 384 ウエルプレートのバックグラウン ド蛍光リード値で正規化した。

これらの結果は、膜結合型Gタンパク質共役型ムスカリン受容体の発現量と機能活性との間に正の相関があることを裏付けている。CHO-K1陰性対照群にカルシウム蛍光シグナルがないことから、ClonePix 2システムが細胞表面にM1 GPCRを発現しているクローンと発現していないクローンを正確に区別できることがさらに確認された。

結論

ハイスループットなスクリーニングと選択性プロファイリングの要求を満たすために、GPCRトランスフェクト細胞株は、細胞ベース機能アッセイのためのユニークでロバスト性かつ均一なプラットフォームである。結論として、これらの予備的研究により、ClonePix 2システムはGPCRクローンの可変発現を確実に検出できることが明らかになった。さらに、蛍光強度は、膜結合型Gタンパク質共役型ムスカリン受容体M1の発現の違いによって引き起こされる、FLIPR Tetraインストゥルメンテーションで測定される細胞質カルシウムレベルのGPCR媒介変化の大きさと正の相関を示した。

したがって、ClonePix 2システムは、それぞれのGPCR発現クローンの検出とピッキングに効率的に使用することができ、高発現レベルの天然エピトープを持つ抗原を用いた抗体作製や、構造的に特徴的なGPCRファミリーに由来する発現が困難なGPCRの細胞ベース機能アッセイなど、様々な用途に高品質のGPCRタンパク質のユニークな供給源として提供することができます。

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