Application Note ClonePixテクノロジーを用いた接着細胞株の迅速な選択

はじめに

この10年間で、哺乳動物細胞によるモノクローナル抗体や組換えタンパク質の生産は最先端の技術となった。しかし、トランスフェクションの効率や導入頻度にはかなりのばらつきがあるため、一過性の細胞株や安定した細胞株を作製することは、多くの細胞種にとって大きな課題となっている。トランスフェクトされた細胞プールから生産性の高いクローンを選択することは、細胞株開発や組換えタンパク質やモノクローナル抗体（mAbs）の製造において大きなボトルネックとなっている。トランスフェクトされた細胞プールには生産性の低いクローンがあふれており、生産性の高いクローンはまれであるため、望ましい高生産性クローンを見つけることは、干し草の山から針を見つけることに等しい。

ClonePix™システム技術と関連試薬は、労力と時間のかかる限界希釈法（手動法）やその他の煩雑な細胞スクリーニング技術を必要とせず、大規模な異種細胞集団から希少クローンを同定・分離するための確立されたワンステップ・ソリューションです。ClonePixシステムは、白色光と蛍光の両方の画像をその場で取り込み、懸濁細胞と接着細胞の両方をピッキングして蛍光タンパク質の発現レベルを定量化します。HEK293細胞株やCHO-K1細胞株のような後者では、さらなるクローン増殖のために細胞の生存性を保持する効率的で穏やかなピッキングプロセスが必要となる。以前、私たちは、分泌産物に特異的な蛍光標識抗体を添加した半固形培地に低密度にプレーティングした浮遊細胞に対して、ハイスループット細胞選択と産物分泌に基づくクローン単離を行うClonePixシステムの能力を実証することに成功しました。このようにして、高生産者がスクリーニングの第一段階で同定されるため、その後の開発期間全体が短縮される。

細胞株開発には懸濁細胞が主に使われるが、懸濁細胞株は従来、トランスフェクションが難しいことが証明されてきた。接着細胞を使用する主な利点のひとつは、トランスフェクションが容易であることで、特に様々なレポーター構築物を試験する場合に優れている。さらに、ClonePixシステムを用いることで、レポータータンパク質の細胞内発現や細胞表面発現に基づく接着細胞の選択が可能になり、スクリーニング・プロセスが非常に容易になる。さらに、ClonePixシステムは、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ／細胞株とは別に、組換えタンパク質を発現するクローンを同定・分離するのにも有用である。細胞内または細胞表面の蛍光強度によって同定された望ましい接着クローンは、それによって安定したタンパク質発現および／または正しいタンパク質コンフォメーションを有するクローンを示すことになる。

緑色蛍光タンパク質と赤色蛍光タンパク質を発現する2つの接着細胞株を用いて、細胞培養で使用するストリンジェンシーが増加する様々な接着細胞ピッキング試薬とClonePix 2システムの有効性を評価した。ここでは、クローンピクス・システムを用いた接着細胞ピッキングのワークフローを紹介する。このワークフローでは、特定の蛍光チャンネルでクローンを画像化し、分析し、効率的にピッキングすることができる。ここに示すデータは、ピッキング後の細胞生存率の維持と、その後の96ウェルプレートでの培養によるクローン拡大を示している。

材料

細胞株

• GenTarget Inc.から入手した蛍光タンパク質を安定的に発現するHEK-293接着細胞株。
  ◦HEK293-緑色蛍光タンパク質/GFP (GenTarget Inc., Cat. #SC001)
  ◦HEK293- 赤色蛍光タンパク質/RFP (GenTarget Inc., Cat. #SC007)

接着細胞ピッキング試薬

• 接着細胞ピッキング試薬テストキットA、B、C、Dタイプ（Molecular Devices社、カタログ番号K8005）
  ◦A：非常に低いストリンジェンシー
  ◦B：低ストリンジェンシー
  ◦C：中程度のストリンジェンシー
  ◦D：高いストリンジェンシー

クローンピクス2システム

• 自動哺乳類細胞コロニーピッキングシステム
• 白色光と蛍光でコロニーをイメージング
• 透過照明により、接着単層膜などの低コントラストのコロニーのイメージングをサポート
• 最大5組の励起／発光フィルターペアをソフトウェアで切り替え可能
• ユーザーが定義可能な基準を用いてコロニーをランク付け
• ターゲットコロニーを同定し、96ウェルプレートにピック
• 浮遊細胞株と接着細胞株の両方で、以下のような複数のアプリケーションをサポートします：

　　　・目的の抗体を分泌するハイブリドーマのスクリーニングと選択
　　　・細胞株開発

クローンセレクトイメージャー

• 胞のラベルフリー白色光イメージング
•  細胞増殖の客観的、定量的評価
• シンプルでユーザーフレンドリーなソフトウェアインターフェース
• 96ウェルプレートの各ウェルにおける成長速度を正確に測定
• 以下のような複数のアプリケーションをサポート
  ◦細胞増殖のモニタリング
  ◦単クローン性の検証

方法

HEK-GFPとHEK-RFPの共培養のプレーティング

HEK-GFP細胞とHEK-RFP細胞を、低細胞密度から高細胞密度の範囲（25細胞/ウェル～300細胞/ウェル）で等しい比率で混合し、一連の6ウェル組織培養処理プレートにプレーティングし、接着コロニーの形成を促した。細胞を37℃、5％CO2の液体組織培養培地中で7日間共培養し、コロニー形成を定期的にモニターした。プレーティング密度が低いと、クローン性のコロニーがばらばらに形成された。

クローンピックス2システムによる接着細胞のスクリーニングとピッキング

コロニー形成に成功したら（通常、プレーティング後7-10日）、接着細胞ピッキング試薬テストキット（Molecular Devices社製、商品番号K8005）を用いて、以下の接着細胞ピッキングプロトコールを実施した。キットに含まれる4種類の付着細胞ピッキング試薬（A、B、C、D）は、非常に低いストリンジェンシーから高いストリンジェンシーまでの範囲で構成されている。各ピッキング試薬溶液A、B、C、Dを用いて、穏やかで効率的な細胞解離とピッキングに適したストリンジェンシーを経験的に評価した。

ピッキング・プロトコル

1. 細胞コロニーから培地を取り除く。
2. ディッシュ／ウェルに等量のAdherent Cell Picking Reagentを分注する。
3. Adherent Cell Picking Reagentを分注する。
4. コロニーをピッキングする前に、室温で最低10分間放置する。
5. PBSで穏やかに洗浄する。液体培地に懸濁する。
6. ClonePix 2システムを使用し、ユーザー定義の基準を用いてコロニーのイメージングと選択を行う。
7. 選択されたコロニーはF2ピン（直径700mm）を使用し、ピッキング設定の'Adherent' Pin Optionで、ピンがプレートの底まで完全に下がるようにしてピッキングした。(F2ピンはF1ピンと比べて直径が広いため、より多くの細胞をプレートの底からピッキングできる）
8. ユーザー指定のピッキング後、各コロニーを96ウェル目的プレートの個々のウェルに移し、クローン細胞を拡大した。CloneSelect Imagerを使用して、7日間定期的に成長/増殖をモニターした。

注：K8005は4種類のピッキング試薬のテストキットであり、効率的なピッキングとピッキング後の生存に最適なストリンジェンシーは、特定の細胞株によって異なる）。

蛍光ベースの画像解析とカスタムクローンの選択

ClonePix 2システムは、白色光とマルチプレックス蛍光チャンネルでのイメージングを可能にした。ユーザーが定義した選択基準を用いて、コロニーは内部の平均蛍光強度に従ってランク付けされた。

図1. GFPおよびRFPクローン

データ表示

イメージングソフトウェアは、in situで生成された一連の画像から、クローンとその分泌レベルの2Dマップを生成する。コロニーのスクリーニングと選択は、いくつかの基準に基づいて行われる：

• 大きさ、丸さ、隣との近さ
• 蛍光レベルによるランク付け
• 近接」ソフトウェア設定により、近接したコロニーは無視される。

緑色のみ、赤色のみ、緑色と赤色の両方の蛍光発現の3つのグループに基づいて、内部平均蛍光を高レベルで示すコロニーをピッキングのために選択した。ピッキングされたコロニーは96ウェルプレートに移され、拡大された。単離したクローンは、CloneSelect Imagerを用いて生存率と成長をモニターした。

クローンセレクト・イメージャーによる細胞増殖の追跡

摘出した細胞の生存率を調べるため、CloneSelect Imagerを使用して、摘出後7日間、96ウェルの目的プレートにおける細胞増殖をモニターした。良好な増殖が見られ、ウェルは7日以内に98%までコンフルエントに達した。ピッキング試薬CおよびDタイプは、AおよびBタイプと比較して、本試験で使用した細胞株に対して最適であった。AおよびBタイプの試薬によるピッキング処理では、プレートの底面からの接着クローンの接着を破壊することはできなかった。異なるタイプの接着細胞株を効率的にピッキングするために、最適なピッキング試薬のストリンジェンシーは、細胞株の本質的な特性によって異なる可能性がある。

蛍光に基づくクローン選別の検証

ピッキングの正確性は、ImageXpress® Micro Widefield High Content Screening Systemを用いてウェルを画像化することにより検証した。HEK-GFPおよびHEK-RFPに分類されたピッキングウェルのうち、98%のクローンがそれぞれGFPまたはRFPのみを示した。これは、ClonePix 2システムが緑色蛍光と赤色蛍光を高い信頼性で正確に区別・選択できることを示している。

図6. HEK-GFPおよびHEK-RFPとしてのみ選択されたウェル

概要

哺乳類細胞培養技術は、基礎研究からワクチン、モノクローナル抗体、生物活性組換えタンパク質などのバイオ治療薬製造のためのバイオ医薬品産業まで、その応用範囲を大きく広げています。ClonePixテクノロジーは、下流での細胞株増殖に不可欠な生存率を維持しながら接着細胞をピッキングする迅速なソリューションを提供します。ClonePixシステムでのピッキングプロセスは、細胞表面タンパク質の酵素消化（トリプシン処理など）に依存しないため、クローナリティを維持しながら、迅速かつ穏やかにコロニーをピッキングすることができます。

ここに記載したストリンジェンシーの異なる4種類の接着細胞ピッキング試薬（A～D）は、幅広い固定依存性細胞株に対して有効であり、クローンピクスシステム上でのクローンの剥離とピッキングを可能にする。ピッキング試薬のストリンジェンシーに対する最適なピッキング効率は、細胞株によって異なり、細胞株固有の特性に依存するため、経験的に決定する必要がある。さらに、これらのピッキング試薬は化学的に定義され、動物性産物を含まないため、増加し続ける規制要件に準拠するための優れた非動物由来の即使用可能な代替品を提供する。

クローンピクス・システムでのイメージングとクローン選択基準は、イメージエクスプレス・マイクロ・システムとの組み合わせで検証されたように、緑色蛍光発現と赤色蛍光発現の正確な区別を提供します。ClonePixテクノロジーは、最適なクローンを選択するための迅速なワンステップ・ソリューションを提供し、バイオ医薬品業界における接着性哺乳類細胞培養技術の将来性を高める一助となる。

ClonePixテクノロジーについてさらに詳しく >>