Application Note Quant-iT RiboGreen RNAアッセイキットによる高感度RNA蛍光定量

100pg/mLまでのRNAを高感度に蛍光定量
4桁に及ぶリニアダイナミックレンジ
SoftMax Proソフトウェアの設定済みプロトコールにより、データ取得と解析が容易

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はじめに

ビバリー・パパス博士｜バイオ研究フィールド・アプリケーション・サイエンティスト｜モレキュラー・デバイス

核酸濃度の正確な定量は、トランスフェクション、クローニング、PCR、次世代シーケンシング（NGS）などのダウンストリームアプリケーションにとって重要である。多くの場合、これらのアプリケーションでは、最適なパフォーマンスを得るために特定のターゲット核酸濃度が設定されています。不正確な定量は、下流のアッセイにおけるばらつきを増加させ、結果の質に影響を与える可能性があります1。

RNAは通常、マイクロプレートリーダーで260nmの吸光度を測定することにより定量される。しかし、吸光度ベースの方法には、夾雑物の干渉、非特異的タンパク質や遊離ヌクレオチドによるシグナルの寄与、感度の限界などの欠点があります2。サーモフィッシャーサイエンティフィック社のQuant-iT™ RiboGreen RNAアッセイキットは、より特異的なRNA定量が可能です。製品マニュアルに記載されているように、マイクロプレートフォーマットのこのアッセイのダイナミックレンジは、2つの色素濃度を用いて1 ng/mLから1 μg/mLであり、吸光度法よりも約1000倍感度が高い3。このアプリケーションノートでは、Quant-iT RiboGreen アッセイを用いると、SpectraMax® iD5 マルチモードマイクロプレートリーダーで、100 pg/mL という低濃度の RNA を確実に測定できることを実証しています。

アッセイの感度を最大化するために、SpectraMax iD5およびSpectraMax® i3x Multi-Mode Microplate Readerで得られたリードに対してSpectral Optimization Wizardを使用し、最適な励起および発光波長を決定しました。SpectraMax iD5 および i3x リーダーのデュアルモノクロメーターは、Spectral Optimization Wizard を使用することで、アッセイに最適な感度とダイナミックレンジを提供する最適な波長ペアに焦点を合わせることができます。

材料

Quant-iT RiboGreen RNA アッセイキット（Invitrogen 社、商品番号 R11490）
96ウェル黒色マイクロプレート（Greiner Bio-One cat.）
ライトセーフブラックマイクロチューブ (Argos 社製 cat. #T7100BK)
マイクロプレートリーダー
SpectraMax iD5 マルチモードマイクロプレートリーダー（Molecular Devices社製 P/N iD5）
SpectraMax i3x マルチモードマイクロプレートリーダー（Molecular Devices P/N i3x）
SpectraMax® M5e マルチモードマイクロプレートリーダー（Molecular Devices P/N M5e）
蛍光フィルターキューブFL-535付きSpectraMax® Miniマルチモードマイクロプレートリーダー（Molecular Devices P/N SMAX MINI AF）（Molecular Devices P/N 5089097）

方法

装置とプロトコルのセットアップ

マイクロプレートリーダーの電源を入れます。
SoftMax® Pro ソフトウェアを起動し、プロトコルマネージャのプロトコルライブラリドロップダウンメニューの核酸フォルダからリボグリーン蛍光プロトコルを開きます。使用する SpectraMax リーダーに応じて、アッセイに最適な設定を選択します（表 1 を参照）。
Acquisition Settings "をクリックし、画面左側のオプションから読み取るウェルとアッセイプレートタイプを選択します。
Template Editor "ボタンをクリックし、マイクロプレートのウェルをあらかじめ設定されたテンプレートグループに割り当てます。RiboGreen Fluorescence のプロトコールには、Standards、Unknowns、Unknowns_Diln（希釈された検体に使用）を含むあらかじめ設定されたテンプレートグループがあります。Add を選択して、High-Range Standards および Low-Range Standards 用に固有の Standard グループを追加することができます。

アッセイの準備

このアッセイについて以下に概説する方法は、Quant-iT RiboGreen RNA 試薬とキットの製品情報シートに記載されている指示に従いますが、アッセイ量が 96 ウェルマイクロプレートフォーマットに適合するように 2.0 mL から 200 μL に比例して減少します。

キットの濃縮バッファー（10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、pH 7.5）を蒸留 DEPC 処理水で 20 倍に希釈し、1X TE バッファーを調製する。
濃縮 DMSO 溶液を 200 倍希釈（ハイレンジアッセイ用：20 ng/mL～1 μg/mL RNA）、2000 倍希釈（ローレンジアッセイ用：1 ng/mL～50 ng/mL RNA）して、Quant-iT RiboGreen 試薬の水性作業溶液を調製する。ガラス表面への試薬の吸着を避けるため、溶液はガラスではなく15mLコニカルチューブに調製する。使用するまで、溶液をホイルで覆い、光から保護する。
ハイレンジ RNA 標準曲線： TEに2μg/mLのRNAストック溶液を調製する。キットに付属のλRNA標準液をTEで50倍に希釈し、2μg/mL溶液とする。このアプリケーションノートでは、表2に従って20 ng/mLから1 μg/mLまでの一連の標準液をLight-Safeブラックマイクロチューブに調製しました。
低域RNA標準曲線： TEに100 ng/mLのRNAストック溶液を調製する。2μg/mLのRNAストック溶液をTEで20倍に希釈し、100ng/mL溶液とする。このアプリケーションノートでは、0.0008 ng/mL から 25 ng/mL までの一連の標準液を表 3a および 3b に従って調製した。表3aは、RNAseフリーのマイクロフュージチューブで調製した低濃度作業希釈液を得るための連続希釈を示す。表3bは、2000倍に希釈したQuant-iT RiboGreen試薬500μLをLight-Safeブラックマイクロチューブ内の低域希釈液に添加した後の最終RNA濃度を示しています。低域標準液を調製するためのこの段階的アプローチは、SpectraMax リーダーでの検出下限を、キットの指示感度 1 ng/mL と比較して評価するために実施しました。
標準液を固形黒色 96 ウエルマイクロプレートに、1 ウエル当たり 200 μL ずつ、3 枚ずつ分注します。
遮光し、室温で2分間インキュベートする。

マイクロプレートを読む

マイクロプレートをドロワーにセットします。SpectraMax Mシリーズリーダーの場合、マイクロプレートをプレートキャリッジ内の紫色プレートアダプターの上に置きます。
SoftMax ProソフトウェアのReadボタンをクリックします。

データの分析

マイクロプレートを読み取った後、データからグループブランクが自動的に差し引かれ、補正された相対蛍光単位（RFU）が Plate セクションに表示されます。データはテンプレートのセットアップ時に作成されたGroup Tablesで分析されます。
各プレートリーダーで読み取られた各標準物質の補正された RFU は、最高標準物質（1 μg/mL）に対して正規化され、実験の High-Range Standard Curve および Low-Range Standard Curve セクションにプロットされます。直線曲線フィットはグラフセクションのドロップダウンメニューから選択します。

Parameter	SpectraMax iD5/iD3	SpectraMax i3x	SpectraMax M5/M5e/M4/M3/M2/M2e	SpectraMax Mini
Read mode	Fluorescence (FL)	Fluorescence (FL)	Fluorescence (FL)	Fluorescence (FL)
Read type	Endpoint	Endpoint	Endpoint	Endpoint
Wavelengths	Excitation: 480 Emission: 520	Excitation: 480 Emission: 520	Excitation: 480 Emission: 525 Emission Cutoff: 515	FL-535 filter cube Excitation: 485/20 Emission: 535/25
Plate type and read area	Select based on microplate and wells used	Select based on microplate and wells used	Select based on microplate and wells used	Select based on microplate and wells used
PMT and optics	PMT gain: Automatic Integration time: 200 ms Read height: optimize for microplate used	PMT gain: Automatic Integration time: 200 ms Read height: optimize for microplate used	PMT gain: Automatic Flashes per read: 6	PMT gain: Automatic Integration time: 200 ms Read height: optimize for microplate used

***表 1.*

SpectraMaxリーダーの装置設定。SpectraMax iD5、i3x、Miniリーダーの場合、リードハイト設定は使用するマイクロプレートに最適化する必要があります。注：同様の性能を持つ他のリーダーもリストアップされています

Standard	Volume (μL) of 1X TE	Volume (μL) of 2 μg/mL RNA Stock	Volume (μL) of 200-fold diluted Quant-iT™ RiboGreen Reagen	Final RNA concentration in Quant-iT™ RiboGreen Assay
High-Range Standard 1	0	500	500	1 μg/mL
High-Range Standard 2	250	250	500	500 ng/mL
High-Range Standard 3	450	50	500	100 ng/mL
High-Range Standard 4	490	10	500	20 ng/mL
High-Range Blank	500	0	500	0

***表2．

ハイレンジ標準曲線作成プロトコール

	Volume (μL) of 1X TE	Volume (μL) RNA	Working RNA Concentration (ng/mL)
Dilution 1	0	1000 μL of 100 ng/mL RNA	50
Dilution 2	500	500 μL of Dilution 1	25
Dilution 3	800	200 μL of Dilution 2	5
Dilution 4	800	200 μL of Dilution 3	1
Dilution 5	800	200 μL of Dilution 4	0.2
Dilution 6	800	200 μL of Dilution 5	0.04
Dilution 7	800	200 μL of Dilution 6	0.008
Dilution 8	800	200 μL of Dilution 7	0.0016
Dilution 9	600	0	0

***表3a.

低域希釈液の調製プロトコール。連続RNA希釈液は、1X TEと100 ng/mL RNAストック溶液を用いて調製する。

	Low-Range Dilution	Volume (μL) of 2000-fold Diluted Quant-iT™ RiboGreen® Reagent	Final RNA Concentration in Quant-iT™ RiboGreen® Assay (ng/mL)
Low-Range Standard 1	500 μL of Dilution 1	500	25
Low-Range Standard 2	500 μL of Dilution 2	500	12.5
Low-Range Standard 3	500 μL of Dilution 3	500	2.5
Low-Range Standard 4	500 μL of Dilution 4	500	0.5
Low-Range Standard 5	500 μL of Dilution 5	500	0.1
Low-Range Standard 6	500 μL of Dilution 6	500	0.020
Low-Range Standard 7	500 μL of Dilution 7	500	0.004
Low-Range Standard 8	500 μL of Dilution 8	500	0.0008
Low-Range Blank	500 μL of Dilution 9	500	0

***表3b．

低域標準曲線作成プロトコール。2000倍に希釈したQuant-iT RiboGreen試薬を表3aの低域希釈液に加え、最終RNA濃度を得る。

結果

Quant-iT RiboGreen アッセイ・キットと SpectraMax リーダーを用いて、100 pg/mL から 1 μg/mL までの RNA 標準物質を検出した。RiboGreen Fluorescence のプロトコールで、SoftMax Pro ソフトウェアは、各標準反復の平均 RFU、標準偏差、および CV%を自動的に算出した。SpectraMax iD5、i3x、M5e、Mini リーダーで測定した高標準物質と低標準物質について、SoftMax Pro ソフトウェアの直線曲線フィットを用いて標準曲線をプロットしました（図 1A、1B）。各曲線の直線性は良好でした（r20.990）

96ウェルマイクロプレートフォーマットで100 pg/mLまでの感度が観察され、検出限界は低レンジブランクの標準偏差の3倍でした。これは、Quant-iT RiboGreen アッセイ製品の添付文書に記載されている 1 ng/mL よりも 10 分の 1 低い値であり、感度が成功に不可欠なアプリケーションにおけるアッセイの有用性が向上していることを示しています。

***図1．
ハイレンジ（A）とローレンジ（B）の標準曲線は、4つの異なるSpectraMaxリーダーで実行した。各標準物質のコアクト平均RFUは、テストしたプレートリーダーの最高標準物質RFU（1 μg/mL）に正規化した。曲線は、SoftMax Pro ソフトウェアの線形曲線フィットを用いてプロットした（ハイレンジ曲線、r20.990；ローレンジ曲線、r20.999）

結論

Quant-iT RiboGreen RNAアッセイキットは、蛍光検出モード付きSpectraMaxマイクロプレートリーダーとSoftMax Proソフトウェアで実行すると、RNAの迅速で高感度な検出法となります。ソフトウエアの分析機能により、読みやすく、ユーザーがカスタマイズできるレポート形式で自動定量が可能です。

参考文献

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