Application Note ImageXpress Nanoシステムを用いて
DNA損傷の評価を効率化

はじめに

ジェイン・ヘスレー｜アプリケーション・サイエンティスト｜モレキュラー・デバイス

DNAや染色体の損傷を評価することは、遺伝子の突然変異、癌、老化を含む様々な疾患において重要な意味を持つため、研究への応用が頻繁に行われている。DNAの損傷は、自然に起こることもあれば、電離放射線、環境の影響や汚染物質、化学物質への曝露によって生じることもある。これまでの研究で、ヒストンH2AXのセリン139上でのリン酸化は、DNA二本鎖切断の早期かつ鋭敏な指標であることが示されている1。

本研究では、リン酸化ヒストンH2AXの免疫蛍光検出に基づき、選択された低分子のDNA損傷効果を特徴付けるための自動細胞イメージングアッセイの開発について詳述する。具体的には、化学療法剤であるMitomycin C（MMC）とエトポシドによる処理に応答して、CHO、HeLa、PC12細胞（すべてのデータが示されているわけではない）の核DNA損傷を定量することが可能となった。

ホスホH2AXの細胞免疫蛍光アッセイはDNA損傷を定量化する

細胞DNA損傷は、市販の試薬を用いてImageXpress® Nano Automated Imaging Systemで可視化・定量化できる。リン酸化H2AX（EMD Millipore）に対する一次抗体とAlexaFluor標識抗二次抗体（Life Technologies）をペアにして細胞免疫蛍光アッセイをデザインした。核はHoechst 33342で対染色し、10倍の対物レンズと標準的なDAPIおよびFITCフィルターセットを用いてImageXpress Nanoシステムで画像を取得した（図1）。

• 384ウェルクリアボトムポリスチレンマイクロプレートに5000～7500細胞/ウェルで細胞を播種する。
• 37°C/5%CO2で一晩培養する。
• DNA損傷化合物の1:2連続希釈液で細胞を18～24時間処理する。
• 4%ホルムアルデヒドで室温で20分間固定する。
• PBSで細胞を洗浄した後、1% BSA+ 0.1% Triton X-100で細胞をブロックし、室温で30分間透過処理する。
• 抗H2AX一次抗体を添加し、4℃で一晩インキュベートする。
  1x PBSで3回洗浄する
• 蛍光標識二次抗体＋16 µM Hoechstを添加し、室温で1～2時間インキュベートする。
• 細胞を1x PBSで3回洗浄する。
• ImageXpress Nano システムで 10X Plan Fluor 対物レンズで画像を取得し、その場で Cell Scoring 解析を行う。

その場での細胞スコアリング解析により、損傷したDNAを持つ核を効率的に特定できる

CellReporterXpress™ 自動画像収集および解析ソフトウェアには、DNA損傷を示す細胞のパーセンテージを計算するだけでなく、DNA損傷マーカーの陽性または陰性として核を分類するように簡単に設定できる、設定済みのCell Scoringアプリケーションモジュールが含まれています。取得ルーチンと解析ルーチンが連動しているため、プレート読み取り終了後、画像と数値データの両方を迅速に確認することができます。さらに、撮影視野が広いため、10倍の対物レンズで単一部位を撮影するだけで、正確な濃度応答曲線を算出することができる（図2）。特に、この倍率で単一視野を撮像すると、試験した最高濃度では500個を超える細胞、亜毒性濃度のマイトマイシンC（MMC）で処理したウェルでは2800個を超える細胞が撮像された。

結論

ヒストンH2AXのリン酸化は、哺乳類細胞における二本鎖DNA切断の鋭敏な指標である。ここでは、マルチウェル・マイクロプレートを用いた免疫蛍光細胞ベースのアッセイにより、CHO細胞におけるDNA損傷の定量を容易に自動化するCellReporterXpressソフトウェアとImageXpress Nanoシステムの有用性を示す。この細胞イメージング・システムの統合された画像取得、オンザフライ解析、即時データ可視化機能（図3）により、DNA損傷に対する濃度応答効果を客観的に評価することが可能となり、手作業による顕微鏡法に比べてデータの質とスループットが向上した。

参考

1. Paull T.T., Rogakou E.P., Yamazaki V., Kirchgessner C.U., Gellert M., Bonner W.M..2000. DNA損傷後の核病巣への修復因子の動員におけるヒストンH2AXの重要な役割。Curr Biol.