2023/6/28
患者由来オルガノイド（PDO）の育て方
創薬や医学研究に関連して、患者由来オルガノイド（PDOあるいは単に "オルガノイド"）が頻繁に話題にのぼる。この記事では、PDOとは何か、そして科学者がどのようにして提供された患者組織からPDOを誘導し、成長させるのかについて説明する。これらの3Dバイオロジー手法は比較的新しく、この研究分野は急速に発展している。
オルガノイドは、その元となる臓器の3D顕微鏡版である。例えば、ミニチュアの "腸 "は、患者の腸から採取した健康な、あるいは病気の生検組織から作ることができる。重要なことは、PDOは、さまざまなセルタイプや基礎疾患を含め、由来する組織を忠実に再現していることである。
写真は大腸癌オルガノイドまたは "ミニ腸 "である。青い染色は個々の細胞のDNAを示し、黄色は構造内の腸腔に相当する空間を示す。左側には3D PDO全体が、右側には中央のスライスが示されている。
研究室でオルガノイドを誘導し、増殖させるのは、手間がかかり、技術的に難しく、コストもかかる。倫理的な配慮やヒト組織を扱う許可とは別に、経験豊かな科学者の技術や高価な装置が必要である。(2004年人体組織法は、人体組織の除去、保存、使用、廃棄に関する活動を規制している）。しかし、その努力に見合うだけの価値がある。というのも、出来上がった構造物は、科学者が身体の仕組みを理解するのに役立ったり、新薬の可能性を試すモデルとして使われることが増えているからである。
患者由来オルガノイドとは何か？
PDOは、患者組織内の「成体幹細胞」から生じる3次元細胞構造体であり、損傷した組織を維持・修復するために再生することができる。PDOは、その由来臓器に特異的に見られる特殊な細胞型に分裂し、形成するよう "あらかじめプログラムされた指示 "を持っている。一度形成されたセルは自己集合し、体内で見られるのと同じ「構造」を再現する。したがって、形成された構造体は「臓器のよう」であることから、オルガノイドと呼ばれる。PDOは、腸、心臓、肝臓、腎臓、膵臓、肺、脳など多くの臓器に由来することができる。サイズが小さく、患者組織を患者の外で忠実に再現できるため、科学者たちは、患者自身では倫理的に実施できないような複数の実験を、研究室でPDOを使って行うことができる！例えば、新薬に対する患者の反応をテストし、正確に予測することができる。
盆栽やスイカの赤ちゃんのように、PDOはオリジナルを小さくしたものに過ぎない。それらを詳細に観察するには顕微鏡が必要である。腸の小腸の断面の直径は約3センチメートル（0.03メートル）であり、研究室で数日間成長させたミニ腸オルガノイドは約75マイクロメートル（0.000075メートル）、つまり400分の1である。
PDOはどこから来るのか？
オルガノイドの元となる組織は、患者の同意のもとに提供される。この組織は通常、臨床医によって採取された針生検から採取される。必要なのは生検の数ミリメートルだけである。培養でオルガノイドを樹立できる可能性は、組織が多ければ多いほど高くなるが、それでもすべてのサンプルからオルガノイドが得られるとは保証できない。
患者の腸組織から「ミニ腸」オルガノイドを作る： ワンステップ・プロセス
患者組織からオルガノイドを誘導する手順は、組織の種類によって異なる。ラボによって、それぞれの要求に合わせた好ましい方法がある。プロセスについて学べば学ぶほど、その方法はより効率的で成功しやすくなっている。以下の例は、腸組織から "ミニ内蔵 "を作成するステップの一般的な概要である。研究室でサンプルを受け取ってから、インキュベーターで培養し、オルガノイドの形成に備えるまで、およそ4時間かかる。オルガノイドの成長は、組織の準備から約2週間かかる。
- 患者の生検組織は、診断に必要な様々な検査に割り当てられる。オルガノイドを誘導するための小さな断片は、特別な保存液に入れられ、研究室に運ばれる間、細胞が生きて正常に機能するように冷やされる。(移植に必要な臓器全体にも同じ溶液が使われる）。
- 研究室では、匿名化されたサンプルは70％アルコールでスプレーされ、生物学的安全キャビネット（BSC）に入れられる。このキャビネットは、オペレーターとサンプルの間を通過する空気の流れを作り出す。これにより、両者の隔離が保たれる。
- サンプルは栄養分と塩分を封じ込めた液体（「培地」）で洗浄され、ペトリ皿の中でメスを使って非常に細かく刻まれる。
- 酵素溶液を加え、体温（37℃）のウォーターバスで約30分間インキュベートする。これにより組織の構造が破壊され、オルガノイドの形成を可能にする「成体幹細胞」が放出される。
- 酵素による消化を培地で止め、混合物を遠心分離機内で高速回転させる。得られたペレットを新鮮な培地に懸濁する。このステップを数回繰り返して、サンプルを "洗浄 "する。
- 細胞/組織フラグメントの小さな塊を含むペレットを4℃に冷やし、Matrigelなどのゲル状タンパク質混合物または同等のものに注意深く再懸濁する。マトリゲルは4℃では液体で、室温ではゲルを形成する。このハイドロゲルは成長因子を供給し、セルが三次元的に発育するための構造的支持体となる。細胞はボール状に形成されるが、その形はサッカーボールのように丸く、突起があるものとないものがある。オルガノイドの中には、全体の形がかなり不規則なものもある。
- 細胞フラグメントとマトリゲルの混合物の小さな塊を滅菌シャーレに置く。この塊は平均的な水滴の大きさ、すなわち0.05mLである。この塊を室温でゲル化させる。液体飼料を加える。これは、細胞の生物製剤を変化させることなく、オルガノイドの成長と発達を促す栄養素と追加因子を封じ込めたものである。その後、ディッシュを37℃、5％の二酸化炭素を一定に保つインキュベーターに移す（標準細胞培養条件）。(標準的な細胞培養条件）。
- 液体飼料は数日ごとに更新され、オルガノイドは約2週間以内に発生する。収量は生検1回につき0～100個のオルガノイドと、非常にばらつきがある。これは組織の種類や、元の生検サンプルの量にもよる。
オルガノイドの数を増やすには
PDOが完全に樹立されたら、それを分割してさらに多くのコピーを播種することができる。これは数日あるいは数週間ごとに行うことができ、臓器の種類や患者によって異なる。オルガノイドのフラグメントに含まれる成体幹細胞は、すでに形成された後により早く形成されることを除けば、元の組織サンプルから形成されるのと同じように新しい細胞を生成し、オルガノイドを形成する。この分割と再播種のプロセスは「サブカルチャー」または「継代」と呼ばれ、何度も繰り返すことができる。これらは、遺伝学や病気に関する小規模な研究に用いることができる。
オルガノイドのサブカルチャー（継代培養）の方法
- オルガノイドを包んでいるマトリゲルを溶かす。
- ピペットチップの狭い開口部からオルガノイドを上下に通過させ、機械的に解離させるか、酵素を封じ込めた薬液を用いて細胞クラスタをばらばらにする。
- スピンして細胞をペレット化し、液体を除去する。
- オルガノイド細胞／フラグメントを新鮮なマトリゲルと混合し、前と同様に培養する。
特許取得済みのバイオプロセス技術を用いて、オルガノイドをスケールアップする。
オルガノイドを手作業で増殖させることは、研究者にとって、実験を遅らせ、コストを増大させる重大な課題となりうる。最も一般的なのは、品質とサイズが均一なオルガノイドを十分な数作れないことである。バッチ間の均一性は、規制された産業環境で採用されている標準化された再現性のあるプロセスなしでは事実上不可能である。
モレキュラー・デバイスは、ヒト由来3Dオルガノイドのスケールアップと工業的製造において、世界的なリーダーシップを発揮しています。特許申請中の当社独自のバイオプロセスにより、当社の半自動化された手順は、制御され監視された条件を使用して、定義されたサイズ範囲内で標準化されたPDOを大量に生産します。厳格な品質管理により、バッチ間およびユーザー間のばらつきを低減しています。
