ハイスループット3Dイメージングの課題を克服する

近年のイメージング技術の進歩により、複雑な細胞ネットワークを3次元的に観察・解析できるようになった。3Dイメージングにより、細胞や組織内の相互作用をより詳細に、より高い精度で取得し、解析することができる。しかし、3Dイメージングには、画像のスキャン時間の長さや解像度の低さ、不十分な解析ツールなど、多くの複雑な課題がある。

ここでは、3D細胞イメージングで直面する一般的な課題と、モレキュラーデバイス製品の助けを借りてそれらを克服する方法をまとめています。

ピンぼけ光

特にワイドフィールド顕微鏡を使用している場合、鮮明な3D画像を得ることは困難です。ワイドフィールド顕微鏡は、迅速な画像取得が可能であるにもかかわらず、ピンボケ信号の除去が不十分です。そのため、ピンボケの強いぼやけた画像となり、画像解析の妨げとなります。

そこで、ピンホールを使用した共焦点顕微鏡があります。ピンホールは、焦点の合っている領域から離れるにつれて焦点外光の感度を下げ、より鮮明な画像を生成します。問題は、1つのピンホールで画像全体をスキャンする必要がある場合に生じますが、これには時間がかかります。

そこでアップグレードの役割を果たすのが、スピニングディスク共焦点顕微鏡（SCDM）である。SDCMは1つのピンホールではなく、数百のピンホールで構成され、高速回転しながら画像をスキャンするため、短時間でより優れた解像度を得ることができる。AgileOptix™スピニングディスク共焦点テクノロジーは、この完璧な例です。

ImageXpress®マイクロコンフォーカルハイコンテントイメージングシステムは、画期的なAgileOptix™スピニングディスクコンフォーカルテクノロジーを搭載し、さらに一歩進んだ高輝度レーザー光源により、より深く組織に浸透するため、厚い組織サンプルでも高解像度の画像を得ることができます。その結果、細胞の視認性が向上し、細胞数が少なくとも30％増加し、より鮮明な画像を得ることができます。

長い取得時間

3Dレーザースキャニング技術が開発される以前は、高画質の画像を得るためには長時間の露光が必要であり、3D画像がウェルスキャンの中心から離れてしまうという課題がありました。今日、共焦点顕微鏡は高輝度レーザーを導入することでこの問題に取り組んでいる。

高輝度光源には、画質を向上させるだけでなく、露光時間を短縮することでスキャン速度を向上させるいくつかの利点があります。

例えば、ImageXpress® Confocal HT.aiハイコンテントイメージングシステムは、8つのイメージングチャンネルを持つ7チャンネルのレーザー光源を搭載しており、露光時間を最大75%短縮できるため、スキャンスピードが全体で2倍向上します。

これは特に、細胞間および細胞内の不均一性を伴う複雑なタンパク質ネットワークのイメージングを必要とするイエローまたはシアン蛍光タンパク質イメージングで威力を発揮します。

信頼性の高い自動フォーカシング

熱や機械的な変動があるサンプルでフォーカスを維持することは困難であり、特にタイムラプスイメージングを妨げる可能性があります。そのため、顕微鏡は自動的に焦点面を検出し、安定させる必要があります。デジタルカメラベースのオートフォーカスシステムは、広い焦点範囲を複雑に探索するプレフォーカスプロセスがあるため、時間がかかります。

最近のレーザーオートフォーカス技術の進歩により、Organ-on-a-chipやU-bottomを含む様々なタイプのPlate上で自動化フォーカスを加速させることができます。

特に、レーザーと画像ベースのオートフォーカスからなるハイブリッドオートフォーカスシステムが最良の結果を生む。このタイプのオートフォーカスは、レーザーが1ウェルにつき1回しか照射されないため、はるかに高速です。しかし、画像ベースのオートフォーカスが持つサンプルとの互換性から恩恵を受けることができます。最も重要なことは、レーザー照射が最小限であるため、生細胞アッセイで重要な光毒性のリスクを最小限に抑えることができるということです。

分析のボトルネック

データセットは大きく複雑であることが多いため、解析に何時間もかかることがあります。このハードルを克服するには、高速処理、正確な画像分類、シンプルなユーザーインターフェースを備えた最先端の画像解析ツールが必要です。

例えば、マルチスレッド並列処理により、タイムラプス解析を最大40倍高速化できることをご存知ですか？これは、MetaXpress®ハイコンテント画像取得・解析ソフトウェア（2Dおよび3Dイメージング用）により現実のものとなりました。画像解析におけるもう一つの課題は、包括的な細胞キャラクタリゼーションのための細胞集団の分類である。ここで機械学習の出番です。IN Carta™画像解析ソフトウェアは、大規模で複雑な細胞プロファイルにおける表現型プロファイルの自動分類を可能にします。

どちらの解析ツールでも、優れたユーザーエクスペリエンスにより、様々なサンプルを用いて数分でプロセスを実行することができます。

難しい光の透過

3Dイメージングで最も困難な作業の1つは、おそらく組織への光の透過です。これは、サンプルの複雑な生物学的挙動に関する情報を得るために非常に重要です。顕微鏡の透過深度に限界がある場合、厚い組織サンプルでは光が散乱したり吸収されたりして画質が低下します。

先に述べたように、共焦点顕微鏡はより優れた解像度を提供することができますが、さらなる開発により、この成功を深い組織への浸透につなげることができます。

顕微鏡のコントラスト能力は、焦点外光を抑制し、試料から発せられる蛍光をよりよく検出するために重要である。これはピンホールによってピンボケ信号を除去することで実現できます。画像スキャン中、複数のピンホールが常に互いに通信していれば、コントラストはさらに速く達成できる。

最後に、共焦点顕微鏡を高輝度レーザー光学系と組み合わせることで、試料にダメージを与えたり光を散乱させたりすることなく、蛍光試料を励起するためにより長い波長の光を送ることができ、より深い浸透が可能になります。

ハイコンテント・データマイニング

マルチウェルやマルチプレートのデータを可視化することを想像してみてください。スタンドアローンの3Dイメージング・ソフトウェアでは、複数の画像のサムネイルやヒートマップを表示するために、アプリケーションを切り替える必要があるでしょう。

データマイニングをより実用的にするためには、画像取得と画像解析およびインフォマティクスを統合し、元の画像から直接データを解析できるインフォマティクスソフトウェアが必要です。この目的を念頭に置いて、Molecular DevicesはAcuityXpress™ハイコンテントインフォマティクスソフトウェアを開発しました。

このソフトウェアは、画像と数値データの間をスムーズに移動できるインタラクティブズーム機能を誇ります。この技術により、個々の高画質画像へのズームであれ、1画面上のすべての画像とデータの全体的な表示であれ、詳細レベルを決定する際に運転席に座ることができます。

最先端のナビゲーションに加え、AcuityXpressソフトウェアには、複雑なデータや複数のパラメーターを一度に解釈できる豊富な解析・計算ツールが用意されています。

結論

3Dイメージングにより、サンプルの複雑な挙動をより深く理解することができますが、それにはいくつかの課題が伴います。モレキュラー・デバイセズでは、イメージングプロセスのあらゆるステップでお客様に寄り添い、特異性の高いソリューションの実現をサポートするよう努めています。

AgileOptix™スピニングディスクテクノロジーによるハイコンテントスクリーニングと、その強力な固体レーザー、水浸対物レンズ、科学的CMOSセンサー、および5つの異なるディスクジオメトリーを持つデュアルディスクスピニングディスクの組み合わせの詳細については、こちらをご覧ください。また、詳細についてはお問い合わせください。