2021/11/30
幹細胞エンジニアリングのための
モノクローナル細胞株の開発方法
モノクローナル抗体や細胞ベースの治療法などの治療薬を作製するための細胞株開発において、モノクローナルの保証は紛れもなく重要である。細胞株を治療用に利用するためには、研究者はコロニー内のセルがシングルセル細胞株由来であることを証明しなければならない。単一細胞からのコロニー成長を追跡する明確な方法がな ければ、単にプレーティングでコロニーを可視化したり、 単クローン性の確信度を用いたりしても、単クローン性の十 分な証明にはならない。では、モノクローナル細胞株を作製し、その単クローン性を検証するために、他に何ができるでしょうか？
Molecular DevicesのCloneSelect® ソリューションは、モノクローナル細胞株開発のために大いに必要とされているワークフロー技術を提供します。我々は最近、アストラゼネカのバイオ医薬品開発部門の科学者であるGargi Royと、幹細胞株エンジニアリングを改善するための現在の課題と機会について議論した。
以前、ロイと彼女の研究チームは、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞から治療用モノクローナル抗体を作製するためにClonePix® FLを使用していた[1]。彼らが幹細胞エンジニアリングに焦点を移したとき、モノクローナル抗体産生という共通項にもかかわらず、2つのワークフローには違いがあることが明らかになった。
アストラゼネカの幹細胞治療チームは、幹細胞エンジニアリングとモノクローナル開発に当社のCloneSelect製品を使用している。さらに、ロイ氏は、彼女のチームがモレキュラー・デバイスのクローンスクリーニング・ソリューションの助けを借りて、より高い精度でモノクローナル細胞株を増殖させる方法について詳述した。本記事では以下も取り上げている：
幹細胞エンジニアリングの概要
幹細胞エンジニアリングは、体細胞（精子細胞や卵細胞を除くあらゆる生物製剤細胞）や胚細胞を、あらゆる細胞種に分化する能力を持つ幹細胞に変えることを含む。このアプローチは、疾患モデル、個別化医療、抗体探索、モノクローナル抗体のような幹細胞を用いた治療薬のための様々な細胞モデルを開発することを目的としている。
幹細胞エンジニアリングには、主に以下の2つのアプローチがある：
- 人工多能性幹細胞（iPSC）： 人工多能性幹細胞（iPS細胞）：体細胞から転写因子を導入することで作製される。
- 胚性幹細胞（ESC）： 未分化の胚内塊細胞から誘導される。
どちらの幹細胞にも共通するのは、モノクローナル抗体の生産に活用できるということである。さらに、幹細胞を介したモノクローナル抗体は、組換えモノクローナル抗体よりも疾患部位への浸透性が高く、血液脳関門（BBB）通過率が高いなどの利点がある。[2].
CloneSelectシングルセルプリンターによる単細胞化
モノクローナル細胞株の作製とそれに続くモノクローナル性評価において、当社のCloneSelectワークフローソリューションが際立っているのはなぜでしょうか？単一細胞をウェルに同時に注入し、ソート時に単クローン性を視覚的に証明できることを想像してみてください。
CloneSelect シングルセルプリンターシリーズは、シームレスなシングルセルの分離を保証し、他の細胞株とのクロスコンタミネーションの可能性を排除しながら、穏やかな細胞分置によりクローンのアウトグロースを最大限に促進します。その動作原理は、単一細胞を液滴に穏やかに封じ込め、ウェルに播種するマイクロ流体技術にあります。さらに、分注された細胞1個につき5枚の画像を取り込み、ソート時にシングルセル分注装置であることを画像ベースで証明します。
このように複雑なシステムでありながら、CloneSelectシングルセルプリンターは特許取得済みソフトウェアで簡単に操作できます。ラボで当社のフィールドアプリケーションサイエンティストチームによる簡単なトレーニングを受ければ、すぐにそのユーザーフレンドリーで細胞に優しい設計の恩恵を受けることができます。セル・フレンドリー」とは、以下の2点を指します：
- 高エネルギーのレーザーを使用しない（細胞へのやさしさは、穏やかな重力導入マイクロ流体工学によって達成される）
- 分注量が少ない（無駄がなく、サンプル間の汚染がない）
おそらく最も重要なことは、CloneSelectシングルセルプリンターの高品質な細胞画像取得は、細胞の形状、サイズ、軸比に基づく排除基準に依存していることです。除外基準により、親細胞と所望の特性を持つエンジニアリング細胞の両方をクローニングすることができます。
モノクローナル細胞株の作り方： 一般的なワークフロー
iPS細胞、ESC細胞、その他多くの細胞種を扱うにせよ、以下に要約するワークフローがモノクローナル細胞株作製の基本である：
- 単一細胞のプリント： 単一細胞の印刷：コロニーを形成するために単一細胞を単離する。
- セル拡大および特性評価： コロニーを形成し、単クローン性を評価し、ジェノタイピング／フェノタイピングアッセイを実施することにより、細胞が目的のタンパク質を発現することを確認する。
- クローン細胞株： セルタイプ特異的分化
親細胞を含む任意の細胞集団から開始し、何かをクローン化したり、任意の特性を持つ細胞を作るためのエンジニアリングに使用するシンプルなワークフロー。
単細胞分離とクローンアウトグロースにおける課題
最先端の単細胞分離技術とモノクローナルワークフローを用いても、いくつかの課題にぶつかる可能性はある。
ガルギ・ロイによると、彼女のチームにとって主な課題は、複数のプレーティングにセルをプリントし、同じ特徴を持つ複数のコロニーを形成したいときに生じた。単細胞分離の再現性が高まるにつれて、クローンアウトグロースの効率は確実に低下する。アニマル・コンポーネント・フリー(ACF)条件を実施しようとすると、その低下はさらに鋭くなる。
クローンアウトグロース効率の差は、iPSCよりもESCの方が顕著である。エンジニアリングESCでは、効率が一桁台まで低下する。その主な理由は、プレーティング中の細胞生存能の低下である、とロイ氏は述べる。彼女はまた、特にACF条件下で培地を濃縮することにより、実験デザインを改善することを強調している。
IPSCとESCの単細胞からのコロニーアウトグロース効率の差は、ESCにおける大きな相違を物語っている。
十分なクローンアウトグロースがあっても、アポトーシスを防ぐために細心の注意を払わなければならない。8～10日のタイムリーな収穫が不可欠である。餓死を防ぐため、コロニーに毎日餌を与えることも有効でしょう。
細胞の凝集は、単クローン性評価を妨げるもう一つの問題である。適切な解離試薬を使用し、ウェル表面からセルを剥離する必要があります。
モノクローナル細胞株開発における保証の難しさ
細胞株開発において、モノクローナリティの検証は極めて重要です。規制当局への申請には、細胞集団が単一細胞由来であることを詳細に証明する必要がある。ロイ氏の研究チームは、ESCは表面が粘着性で形状が不規則であるため、モニタリングが特に困難であることを発見した。近接した2つのESCが注装置された場合、それらはシングルセルとして検出される可能性が高い。また、締め切りが迫っている場合は、統計の限界希釈法を適用して、単クローン性の可能性を計算することもできる。
CloneSelect 単一細胞プリンターは、単一細胞の単離の時点で単クローン性を証明する高度なイメージング技術を誇ります。このプリンターは、細胞成膜中に非常に近い2つのセルを簡単に区別できるだけでなく、下の図に見られるように、コロニーを採取した日から0日目までさかのぼって単クローン性を保証することができます。
CloneSelectシングルセルプリンターによる単クローン性の確認とシングルセルイメージの取得
クローンの特性化
細胞株開発の最後の要素は特性化である。単クローン性が評価されたら、この単クローン性がジェノ タイピングと多能性に反映されていることを確認します。コロニー内のセルは全て、希望する機能性を一貫したレ ベルで持っているのだろうか？さらに重要なことは、コロニーがゲノム的に安定しているか、つまり遺伝物質を保存し、ある世代から次の世代へと受け継ぐことができるか、ということです。最後に、その細胞は多能性（すなわち、外胚葉、内胚葉、中胚葉という3つの主要な生殖層に分化できるか）なのか？その答えは、ハイスループット・クローン・スクリーニングによってのみ得られる。
CloneSelect Imager は、単クローン性保証のさらなる信頼性により、研究に付加価値を与えることができます。CloneSelect イメージャーには、標識不要の明視野テクノロジーとカスタマイズ可能な蛍光イメージが搭載されており、コンフルエンス測定、成長曲線、モノクローナリティレポートの作成、各ウェルのコロニーのアウトグロースを素早く可視化するプレートサムネイルなどの高度なデータ解析ツールが付属しています。
高解像度と多彩なイメージングモードにより、クローン内の細胞に特異的な細胞マーカーを検出することもできます。これにより、モノクローナル細胞株が望ましい機能を有しているかどうかを確認することができます。
下の図は、モノクローナルESCが3つの異なる生殖細胞層に分化し、各層にそれぞれのバイオマーカーが存在することを示しています。
内胚葉、中胚葉、外胚葉の3つの生殖細胞層への分化を容易にします。
CloneSelect シングルセル・プリンターは、iPS細胞やESC細胞のシングルセル単離に効果的なツールです。CloneSelect Imager と CloneSelect プリンターを組み合わせることで、画像ベースで単細胞性を証明することができます。
- アストラゼネカ、バイオ医薬品開発部細胞培養・発酵科学博士、Gargi Roy氏
CloneSelect Imagerの機能評価範囲は、細胞分化段階を開始した後も継続します。蛍光イメージャーにより、細胞が分化して異なる組織層を形成する様子をモニターすることができます。
モノクローナル細胞株についてもっと知りたいのですが？
最初のプレーティング段階からアウトグロース、細胞分化に至るまで、モノクローナル細胞株開発は、モノクローナル保証のための CloneSelect ワークフローを使用することでよりシンプルになります。
CloneSelect Single-Cell Printer および CloneSelect Imafer のモノクローナル保証ワークフローの詳細については、アストラゼネカ幹細胞チームの研究をご覧ください。最近のMolecular Devicesのウェビナーでは、Gargi Royが、モノクローナル細胞株をエンジニアリングし、コロニー内の細胞を評価する方法を示す彼女の研究の詳細を用いて、モノクローナリティ保証における課題と解決策を説明しています。
- Roy, Gargi, et al. "Sequential screening by ClonePix FL and intracellular staining facilitate isolation of high producer cell lines for monoclonal antibody manufacturing." Journal of immunological methods 451 (2017): 100-110.Roy, Gargi, et al. "Sequential screening by ClonePix FL and intracellular staining facilitate isolation of high producer cell lines for monoclonal antibody manufacturing." Journal of immunological methods 451 (2017): 100-110.
- Frank, Richard T et al. “Concise review: stem cells as an emerging platform for antibody therapy of cancer.” Stem cells (Dayton, Ohio) vol. 28,11 (2010): 2084-7. doi:10.1002/stem.513.Frank, Richard T et al. “Concise review: stem cells as an emerging platform for antibody therapy of cancer.” Stem cells (Dayton, Ohio) vol. 28,11 (2010): 2084-7. doi:10.1002/stem.513.
