Application Note 3D免疫細胞の遊走

  • 簡単に拡張でき、ハイコンテントイメージングに対応した複雑な細胞遊走アッセイを作成する。
  • 免疫細胞の動態を定量的に評価し、細胞数や細胞遊走距離などのハイスループット測定値を得る。
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はじめに

Angeline Lim, PhD | Applications Scientist | Molecular Devices
Oksana Sirenko, PhD | Sr. Applications Scientist | Molecular Devices
Thomas Olivier | Bioinformatics Engineer | MIMETAS
Johnny Suijker | Scientist | MIMETAS

細胞の遊走は、初期胚発生や免疫細胞応答など、多くの生物学的プロセスにとって不可欠である。炎症時には、血管系を通って炎症部位に向かうT細胞のリクルートが重要な要素となる。これらのT細胞は、炎症性サイトカイン（TNFα、IFN-γ）やケモカイン勾配などの様々な因子によってリクルートされる。T細胞は、内皮に動員され接着した後、経内皮遊走（TEM）と呼ばれる過程を経て、血管壁を越えて炎症組織に遊走する必要がある。これには、生体組織の複雑な3D環境をうまく通り抜け、細胞外マトリックス（ECM）を再構築することによって、あるいは特異的な細胞適応を受けることによって、緻密な構造を通り抜けることが必要である。

この研究では、MIMETASのOrganoPlate® 3-Lane 40を利用したin vitroアッセイを開発し、灌流条件下で血管構造と組み合わせたT細胞の動態を研究することにした。ヒト初代T細胞を血管内腔に先端から添加し、様々な因子の存在下または非存在下で、その後の血管外遊出と隣接ECMへの遊走を研究した。ハイコンテンツイメージングを用いて、様々な時点における細胞の遊走を観察した。ここでは、異なる濃度の炎症性サイトカインに応答して経内皮遊走する細胞数を定量するために用いたイメージングと解析方法について述べる。

材料

  • オルガノプレートプラットフォーム（MIMETAS）
  • 内皮細胞源
  • CD3+ T細胞
  • AIM V培地（Invitrogen, 12055091)
  • コラーゲン I 5 mg/mL (AMSbio Cultrex 3D collagen I rat tail, 5 mg/mL, #3447-020-01)
  • 1M HEPES（Life Technologies 15630-122）
  • 37g/L NaHCO3（Sigma S5761-500G）
  • PBS (シグマ)
  • CellTracker Orange CMRA (Invitrogen, C34551)CellTracker Orange CMRA (Invitrogen, C34551)
  • CD3/CD28 Human T-activators DynaBeads (Gibco, 11161D)
  • TNFα（R&Dシステムズ、210-TA-020）
  • ケモカイントリガー
  • ImageXpress Micro コンフォーカルハイコンテントイメージングシステム（Molecular Devices社製）
  • MetaXpressハイコンテント画像取得・解析ソフトウェア、バージョン6.6 (Molecular Devices)

メソッド

モデル

灌流条件下で血管構造と組み合わせたT細胞動態を評価するために、内皮血管をOrganoPlate 3-laneで培養した。内皮細胞をコラーゲンI細胞外マトリックス（ECM）に対して、上部の灌流チャンネルに10,000細胞/チップの密度で播種した。接着後、培養は灌流条件下で維持され、灌流チャンネル内に3D微小血管が形成された。微小血管の炎症状態は、炎症性サイトカインであるTNFαを用量依存的に添加することで模倣され、内皮の接着特性を誘導し、経内皮遊走に関与した。このモデルでは、OrganoPlate 3-laneの底部チャンネルにケモカインを添加することにより、ケモカイン勾配を得た。CD3/CD28ヒトT-アクチベーターDynabeadsを用いて48時間刺激または非刺激したCD3+ T細胞を細胞追跡装置で標識し、内皮血管から隣接する細胞外マトリックスへのT細胞の血管外遊出をライブで追跡できるようにした。

図1. OrganoPlateにおけるT細胞灌流内皮オンチップモデルの確立。A) 3つの流路からなるOrganoPlate® 3-Lane 40マイクロ流路チップの一つを示す概略図。これらの流路はチップ中央の観察窓（OW）ウェルで合流する。B) 免疫細胞灌流内皮オンチップモデルを確立するための播種戦略の模式図。

実験セットアップ

CD3+T細胞を培養し、ヒトT-activator Dynabeadsを用いて48時間刺激するかしないかを選択した。

イメージングと解析

ImageXpress® Micro Confocal System（Molecular Devices）を用いて、T細胞の遊走と組織化の画像を一定間隔で撮影した。10x対物レンズ（0.45NA）と60μmニプコウスピニングディスクを用い、0.69x0.69x3μm/ピクセル（XYZ）の解像度で蛍光画像のZ-スタックを取得した。次に、スタックをZ軸に沿って投影し、データの最大強度投影（MIP）を作成した。

次に、MetaXpress®ソフトウェア（バージョン6.6、Molecular Devices）のカスタムモジュールエディター（CME）を用いて構築したカスタムプロトコルを用いて、すべての画像を解析した（図3）。簡単に言えば、CMEにはCount Nucleiアプリケーションモジュールが含まれており、バックグラウンドレベルを超えるサイズと強度に基づいてT細胞を同定した。ECMチャンネル内に存在する集団を同定するために、一連のフィルタリングステップが使用された（図2）。ECMチャンネルの正確な位置は、プレート間およびプレーティングのばらつきを補正するために、実験ごとに定義された。

図2. 画像取得と解析のワークフロー。A) ImageXpress マイクロコンフォーカルハイコンテントスクリーニングシステム（Molecular Devices）。B) MetaXpressカスタムモジュールエディターのユーザーインターフェース。画像処理ステップは左側のステップで定義され、現在のステップの画像と結果のプレビューは右側に表示され、ワークフロー全体は下側のサムネイルに表示される。図2. 画像取得と解析のワークフロー。A) ImageXpress マイクロコンフォーカルハイコンテントスクリーニングシステム（Molecular Devices）。B) MetaXpressカスタムモジュールエディターのユーザーインターフェース。画像処理ステップは左側のステップで定義され、現在のステップの画像と結果のプレビューは右側に表示され、ワークフロー全体は下側のサムネイルに表示される。

図3. ハイスループット画像解析用にセットアップされたカスタムモジュールエディター。A) T細胞集団の同定に使用した主なステップを示す。Count Nucleiアプリケーションモジュールは、画像内の全セルを検出するために使用された。得られた画像は、ECMチャンネル内の細胞をより正確に同定するため、位置（セントロイドY）と面積でフィルタリングされた。必要であれば、位置による追加フィルタリングを使用して、底部チャネルへの遊走の程度を分類することができる。細胞数、面積、強度、形状因子を含む特異性測定も、測定選択設定タブで利用可能です。B) 内皮血管とCD3+ T細胞の位相差画像。C) 前サンプルのCy5蛍光シグナル（拡大）。D) CD+ T細胞のECM集団のセグメンテーションオーバーレイを示すCME解析結果。ティール色の細胞はECMチャンネルの上半分に存在し、黄色い細胞はECMチャンネルの下半分に存在する。画像は、セグメンテーションルーチンで誤検出される可能性のある画像アーチファクトがないかチェックされる。

結果

経内皮遊走（TEM）は未刺激および刺激CD3+ T細胞の両条件で観察された。非刺激条件でも刺激条件でも、時間依存的な効果が観察されたが、非刺激条件ではより微妙な傾向がみられた（図4Bと4C）。刺激条件では、24時間の時点ではTEMの増加はほとんど観察されなかったが、無刺激条件では、24時間と48時間の時点の両方で、TNFα処理の用量依存的効果が観察された。48時間の時点におけるTEMの総量は、非刺激条件よりも刺激T細胞条件の方が有意に多かった。TEMの総量は、非刺激条件ではTNFαが介在する効果によって、刺激T細胞条件では刺激過程によって左右されるようである。

図4. TNFα処理に対する刺激の有無によるT細胞の遊走。A)TNFα処理0時間、4時間、24時間、48時間における、セルトラッカーで標識した非刺激T細胞。内皮細胞バリアの反対側の細胞数の増加が経時的に観察された。B) TNFα処理に反応して遊走した刺激T細胞の定量化。C)TNFα処理に反応して遊走した非刺激T細胞の定量化。TNFαの量をpg/ml単位でx軸に示す。

結論

結論として、我々はハイスループットのマイクロ流路プラットフォームを用いた、新しい3D T細胞遊走アッセイ法を開発した。ハイコンテント顕微鏡を用いて、個々のT細胞の遊走挙動の正確なマップを抽出し、異なる条件下で評価することができる。遊走アッセイでは、流動下でのT細胞の内皮血管への接着と、この血管壁から下層組織への血管外遊出を捉える。このアッセイは人工膜に妨げられることなく、生体内条件を模倣するために重要な要件である、3次元ECM様スキャフォールドと多細胞共培養の存在を可能にする。このアッセイは、T細胞の遊走行動に関する現在の知見を向上させ、免疫腫瘍学や自己免疫の分野における新規治療法の開発に拍車をかけることができると確信している。

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