TRF / TR-FRET（HTRF）の概要
時間分解蛍光(TRF)
蛍光強度(FI)測定では、フルオレセインのような標準的な蛍光色素を使用します。蛍光色素の発光はナノ秒オーダーと短命です。サンプルの励起と発光の測定は同時に行われます。マイクロプレートリーダーは、発光測定から励起光を除外するのに非常に優れていますが、励起光は、ウェルやサンプル中の物質から放出される短寿命の光とともに、しばしば高いバックグラウンドの原因となります。
時間分解蛍光法（TRF）は、長寿命の蛍光を発するランタニド蛍光体（ユーロピウムやテルビウムなど）を用いることで、バックグラウンドを低減します。この長寿命蛍光はミリ秒単位で持続するため、パルス光源（フラッシュランプなど）で蛍光体を励起した後、遅延時間をおいてからシグナルを測定する（「計数窓」）ことで、短寿命蛍光（ナノ秒単位で持続）が落ち着いてから測定を行うことができます。時間分解蛍光を用いたアッセイでは、シグナル対ノイズ比が飛躍的に向上します。最も頻繁に使用されるランタノイドは、ユーロピウム、テルビウム、サマリウムです。これらは一般的にキレート複合体またはクリプテート複合体として使用され、シグナル強度と安定性に優れています。
時間分解蛍光共鳴エネルギー移動(TR-FRET)
ドナーとアクセプターが離れている ドナーとアクセプターが接近している
TR-FRETは、蛍光の時間分解（TR）測定と蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）技術を組み合わせたものです。FRETアッセイでは、生体分子（タンパク質など）はドナー蛍光体とアクセプター蛍光体で標識されます。生体分子が相互作用すると、ドナー蛍光体とアクセプター蛍光体が接近します。ドナーが励起されると、その発光エネルギーをアクセプターに伝達することができ、アクセプターは特異性波長で蛍光を発します。アクセプターとドナーの蛍光発光は波長が異なるため、マイクロプレートリーダーで互いに区別することができ、生体分子相互作用の定量が可能になります。
ドナーとして長寿命の蛍光を発するランタニド蛍光体を用いるTR-FRETアッセイは、蛍光の時間分解測定を利用し、短寿命のバックグラウンド蛍光を除去します。TR-FRETアッセイでは、ドナー蛍光体の長寿命発光のおかげで、短寿命のバックグラウンド蛍光が減少した後に、ドナー蛍光体とアクセプター蛍光体の両方の励起と発光を測定することもできます。
ホモジニアス時間分解蛍光 (HTRF)
HTRFは、生体分子の相互作用を検出するためにシスバイオが開発した汎用性の高いTR-FRET技術です。典型的なHTRFアッセイでは、ドナーとしてユーロピウムクリプテートを、アクセプターとして有機蛍光体d2を用います。ドナーとアクセプターは、エピジェネティクス、バイオマーカー定量、GPCRシグナル伝達などを含むアプリケーションのために、様々な生体分子を標識するために使用することができます。HTRFアッセイには、シスビオのHTRF適合認定を受けたTRF検出モードのマイクロプレートリーダーが必要です。
利点と留意点
TRFおよびTR-FRET検出の主な利点は、標準的な蛍光に比べてバックグラウンドノイズが減少し、シグナル対SN比が向上するため、感度が高くなることです。さらに、このアッセイは洗浄を必要としない混合＆測定形式を採用しています。これは、アッセイの安定性とともに、スクリーニングアプリケーションの自動化や小型化を容易にします。
