単クローン性

単クローン性の文書化――治療用セルラインの規制指標

なぜ単クローン性が重要なのか？

細胞株開発の規制がますます厳しくなるにつれ、研究者はシング ルセル細胞クローニングを実施し、細胞株が単一細胞に由来するという証拠（クローナリティの証明）を提出することが要求されるようになるでしょう。伝統的なクローニング法（限界希釈法やFACSなど）では、単クローン性の信頼レベルを決定するために統計的分析を行います。しかし、単クローン性の文書化には、バイオプロセスにおいてよりロバストな技術と方法論が必要です。現在、多くの研究者がCloneSelect Imafer などのイメージングシステムを日常的に使用して単クローン性を検証し、細胞培養培地中の細胞増殖をモニタリングしています。

細胞株開発における単クローン性の確認

目的の特異的タンパク質を発現する細胞株の開発は、生物製剤の開発に不可欠であり、規制当局は、生物製剤を市場に出すために、単クローン性の証拠を要求します。従来のアプローチでは、0日目に透過白色光を用いてウェルを可視化し、単一細胞の存在を確認します。しかし、細胞残屑やウェルのアーティファクトが簡単にセルと間違われる可能性があるため、このアプローチに課題がないわけではありません。そのため細胞株開発者は通常、コロニーの状態で細胞を評価し、コロニーの起源をたどって単クローン性を確認します。

このワークフローでは、CloneSelect Imager Systemを使用して、対物レンズ解析に基づいて単クローン性を確認するプロセスを紹介します。シングルセルソーティング用のDispenCell™シングルセル注装置と組み合わせることで、クローンアウトグロースの増加、および単クローン性の画像ベース保証の追加により、ワークフローが改善されます。

• マイクロプレートウェルへのシングルセルのソーティング
  細胞集団が遺伝学的に同一であることを確実にし、発現の不均一性を著しく低減するために、生きたシングルセルを単離し、クローン化する必要があります。
• 0日目以降のプレートWLのスキャン
  0日目以降のプレートを画像化します。単クローン性（治療用細胞株の規制指標）の文書化は、通常は画像ベースとなっており、シングルセル細胞株の画像の記録は、規制当局へ提出書類に含まれています。
• プレートスキャンをレビューし、全体的なアウトグロース（WL）を評価する
  細胞増殖速度、コンフルエンス測定、コロニー形成を追跡する画像をレビューし、解析します。
• モノクローナリティを確認し、薬事申請用にウェルデータをエクスポート
  モノクローナリティを確認し、薬事申請用に詳細レポートにウェルデータをエクスポートします。
  
  

シングルセル分注装置でクローンアウトグロースの改善

DispenCell™シングルセル分注装置には、細胞の通過を検知するセンシングチップが装着されています。各セルが前進すると、それをトリガーとして固有の電気シグナルが発生します。このユニークな電気的軌跡は即座に記録され、細胞を分注した直後にクローン性の証明を確認することができます。

この技術はインピーダンス・ベースであるため、細胞に非常に優しく、最適なアウトグロースのために細胞の生存率と完全性を保つことができます。DispenCellは、滅菌済みのディスポーザブル・センシングチップ（DispenTip）を使用し、DispenTipの開口部を流れるすべての細胞の通過を感知し、記録します。単一のセルがアパーチャーを通過してウェルに流れ込むと、固有のピークとして現れる電気的シグネチャーが残りますが、ダブレットや複数のセルでは複数のピークが生じます。

何がモノクローナルで何がモノクローナルでないか

CloneSelect Imager ソフトウェアを使用して固定化したコロニーを個々に拡大することにより、成長を追跡し、異なる時点のコロニー画像を確認します。これによりコロニーがモノクローナルかどうかを判断することができます。下図に、2つのコロニーの画像を示します。２つのコロニーの成長を観察し、0日目までさかのぼって画像を追跡することで、そのコロニーが1つまたは複数の細胞に由来するかどうかを決定できます。半固形培地にビーズ（黄色の丸で示す）を加えることで、毎回同じコロニーを撮像していることを確認するための位置参照として役立ちます。