モノクローナリティとは
モノクローナリティ(単クローン性)とは、単一の前駆細胞(シングルセル)に由来する細胞株、つまりモノクローナルであることを表す用語です。細胞株開発とモノクローナリティの保証は、モノクローナル抗体などのバイオ医薬品分子を作製するプロセスにおいて重要なステップです。細胞株は、目的のタンパク質をロバストに発現する生きたシングルセルを単離した後に樹立することができます。このプロセスにおける重要なマイルストーンは、細胞株の遺伝的再現性を保証するために、クローナリティの証拠を文書化することです。
モノクローナリティの証明は、治療用細胞株の規制上の指標であり、通常画像ベースで行われます。
なぜモノクローナリティが重要なのか?
細胞株開発の規制がますます厳しくなるにつれ、研究者はシング ルセル細胞クローニングを実施し、細胞株が単一細胞に由来するという証拠(クローナリティの証明)を提出することが要求されるようになるでしょう。伝統的なクローニング法(限界希釈法やFACSなど)では、モノクローナリティの信頼レベルを決定するために統計的分析を行います。しかし、モノクローナリティの文書化には、バイオプロセスにおいてよりロバストな技術と方法論が必要です。現在、多くの研究者がCloneSelect Imager などのイメージングシステムを日常的に使用してモノクローナリティを検証し、細胞培養培地中の細胞増殖をモニタリングしています。
細胞株開発におけるモノクローナリティの確認
目的の特異的タンパク質を発現する細胞株の開発は、生物製剤の開発に不可欠であり、規制当局は、生物製剤を市場に出すために、モノクローナリティの証拠を要求します。従来のアプローチでは、0日目に透過白色光を用いてウェルを可視化し、単一細胞の存在を確認します。しかし、細胞残屑やウェルのアーティファクトが簡単にセルと間違われる可能性があるため、このアプローチに課題がないわけではありません。そのため細胞株開発者は通常、コロニーの状態で細胞を評価し、コロニーの起源をたどってモノクローナリティを確認します。
このワークフローでは、CloneSelect Imager Systemを使用して、対物レンズ解析に基づいてモノクローナリティを確認するプロセスを紹介します。シングルセルソーティング用のDispenCell™シングルセルディスペンサーと組み合わせることで、クローンアウトグロースの増加、およびモノクローナリティの画像ベース保証の追加により、ワークフローが改善されます。
- マイクロプレートウェルへのシングルセルのソーティング
細胞集団が遺伝学的に同一であることを確実にし、発現の不均一性を著しく低減するために、生きたシングルセルを単離し、クローン化する必要があります。 - 0日目以降のプレートWLのスキャン
0日目以降のプレートを画像化します。モノクローナリティ(治療用細胞株の規制指標)の文書化は、通常は画像ベースとなっており、シングルセル細胞株の画像の記録は、規制当局へ提出書類に含まれています。 - プレートスキャンをレビューし、全体的なアウトグロース(WL)を評価する
細胞増殖速度、コンフルエンス測定、コロニー形成を追跡する画像をレビューし、解析します。 - モノクローナリティを確認し、薬事申請用にウェルデータをエクスポート
モノクローナリティを確認し、薬事申請用に詳細レポートにウェルデータをエクスポートします。
シングルセルディスペンサーでクローンアウトグロースの改善
DispenCell™シングルセルディスペンサーには、細胞の通過を検知するセンシングチップが装着されています。各セルが前進すると、それをトリガーとして固有の電気シグナルが発生します。このユニークな電気的軌跡は即座に記録され、細胞を分注した直後にクローン性の証明を確認することができます。
この技術はインピーダンス・ベースであるため、細胞に非常に優しく、最適なアウトグロースのために細胞の生存率と完全性を保つことができます。DispenCellは、滅菌済みのディスポーザブル・センシングチップ(DispenTip)を使用し、DispenTipの開口部を流れるすべての細胞の通過を感知し、記録します。単一のセルがアパーチャーを通過してウェルに流れ込むと、固有のピークとして現れる電気的シグネチャーが残りますが、ダブレットや複数のセルでは複数のピークが生じます。
何がモノクローナルで何がモノクローナルでないか
CloneSelect Imager ソフトウェアを使用して固定化したコロニーを個々に拡大することにより、成長を追跡し、異なる時点のコロニー画像を確認します。これによりコロニーがモノクローナルかどうかを判断することができます。下図に、2つのコロニーの画像を示します。2つのコロニーの成長を観察し、0日目までさかのぼって画像を追跡することで、そのコロニーが1つまたは複数の細胞に由来するかどうかを決定できます。半固形培地にビーズ(黄色の丸で示す)を加えることで、毎回同じコロニーを撮像していることを確認するための位置参照として役立ちます。
モノクローナリティの証拠画像の提供(レポート)
細胞株開発プロセスにおけるモノクローナリティの証拠となる画像の提供は、シングルセル細胞株の画像をエクスポートするという単純なものではありません。例えば、ウェル全体の高解像度画像も検査し、2番目の細胞がないことを確認する必要があります。
CloneSelect™ Imager (CSI)のモノクローナリティレポート機能は、数回クリックするだけで、クローナリティの立証に必要な証拠画像を客観的に整理し、簡単に共有可能なレポートにまとめることができるため、従来同じプロセスを手作業で行うために必要だった研究者の作業時間を短縮します。