Application Note 標識不要腸オルガノイドのAIによる表現型解析

はじめに

Zhisong Tong | Research Scientist | Molecular Devices
Prathyushakrishna Macha | Research Scientist | Molecular Devices

スフェロイドやオルガノイドのような3次元（3D）モデルは、単層2D培養モデルに比べて生体内環境をよりよく再現できるため、多くの研究分野で人気を集めている。近年の3Dオルガノイド培養技術の進歩により、人工多能性幹細胞（iPSC）や成体幹細胞を用いて、臓器のような構造を3Dで培養できるようになった。小腸はターンオーバーが速く、急速に更新される組織である。小腸の主要な構成成分は、クリプトと絨毛という大きな単位を交互に繰り返す単一の上皮層に存在する（図1）。これらの陰窩、すなわち腸の拡張部には幹細胞が封じ込められ、分裂して前駆細胞を生み出す。このように、クリプトは腸オルガノイドの重要な部分であり、成熟したオルガノイドはより複雑で多数のクリプト構造を持つ。

オルガノイドの応用分野には、ハイコンテントスクリーニングアプローチを用いた創薬や再生医療などがある。ここでは、ImageXpress® Pico自動細胞イメージングシステムとCellReporterXpress自動画像取得・解析ソフトウェアを用いて、腸オルガノイドの画像化を行った。CellReporterXpressは、様々なアプリケーションのためのガイド付きワークフローを備えたビルトインプロトコルを提供することにより、ハイコンテントイメージングの複雑さを軽減する。例えば、新規プレート取得とスティッチングプレート取得は、複数画像のスティッチングの有無にかかわらず、画像取得によく使用される2つのプロトコルです。ステップバイステップのガイド付きワークフローにより、初めて画像取得を行うユーザーでも簡単に独自の取得プロトコルを設定できます。カスタマイズされたプロトコルは保存することができ、後でワンクリックでイメージングを実行することができます。

CellReporterXpressの使いやすさは画像取得だけにとどまりません。強力な画像解析ソフトウェアはOn-the-fly解析が可能です。ユーザーは、細胞計数、生細胞／死細胞解析、神経突起トレーシング、血管新生アッセイなど、一般的に使用される画像解析ツールを含む25の設定済み解析プロトコルのいずれかを使用することができます。シンプルなワークフローに加え、CellReporterXpressのユーザーはIN Carta®画像解析ソフトウェアの人工知能ツールを使って高度な画像解析を行うこともできます。IN Cartaには、核、細胞、点状組織、線維、神経突起などの一般的な生物学的構造をセグメンテーションするためのアルゴリズムが組み込まれているほか、ディープラーニングベースのセグメンテーションツールであるSINAP（オプションモジュール）が搭載されており、ユーザーはカスタマイズしたニューラルネットワークモデルを作成することができます。さらに、IN Cartaには2つの分類ツールがあります。手動決定木分類器は、ユーザーが定義した尺度に基づいており、Phenoglyphs分類器は、機械学習アルゴリズムに基づいています。

このアプリケーションノートでは、オルガノイドの表現型や形態の変化を記述・測定するために、イメージングや画像解析手法を用いる一般的なアプローチについて述べる。方法は、由来や開発プロトコルに関係なく、あらゆるオルガノイドに適用できる。さらに、ImageXpress Pico自動細胞イメージングシステムとCellReporterXpressおよびIN Carta画像解析ソフトウェアを用いた腸オルガノイドのイメージングと解析のワークフローを紹介する。 図1.腸オルガノイドの構造を示す2D Cartoon。特にIN Cartaでは、SINAPによる画像セグメンテーションの後、Phenoglyphsによる分類が行われた。このアプローチを用いて、腸オルガノイドを画像化し、解析し、未熟、中間、成熟クラスに分類する簡単な方法を実証する。このAIを利用した分類アプローチは、培養中の腸オルガノイドの成長と発達のモニタリングに利用できる。

方法

オルガノイドイメージング

オルガノイドイメージングの一般的なワークフローを図2に示す。オルガノイドの画像は、CellReporterXpressを使用し、ImageXpress Picoシステムで透過光（TL）で取得した。Z-スタック画像の2Dプロジェクションは、10X対物レンズ、10µmフォーカスステップ、ウェルボトムオートフォーカスで取得した。フォーカスオフセットは CellReporterXpress が自動的に決定した。

画像解析

画像はCellReporterXpressからIN™ソフトウェア互換フォーマットにエクスポートした。ディープラーニングベースのセグメンテーションモジュールであるSINAPを使用し、複数の画像をトレーニングセットとしてロバスト性の高いカスタムモデルを作成した。この新しく学習されたモデルは、以後すべての画像の解析に使用された。機械学習ベースの分類ツールであるPhenoglyphsを使用して、取得したすべてのオルガノイドを未熟、中間、成熟クラスに分類した。

結果

CellReporterXpressによる3Dスタッキング画像の2Dプロジェクション。

マウス腸管オルガノイドの画像は、1ウェル内のすべての部位をスティッチングした画像を生成するスティッチングプレーティング取得プロトコルで取得した。腸オルガノイドは3Dであるため、Zスタッキングモードを選択し、オルガノイド全体をカバーする適切なZ平面のスタックを選択した。CellReporterXpress には、透過光チャンネルに対するさまざまな Z プロジェクション・オプション（平均、ベスト・プレーン、ベスト・フォーカス・小物レンズ、ベスト・フォーカス・大物レンズ）が用意されている。平均Zプロジェクションは全プレーンの強度を平均化し、ベスト・プレーンはベスト・フォーカスの1プレーンをピッキングし、他の2つのプロジェクションは画像を小さなゾーンに分割し、各ゾーンについて全Zプレーンにわたるベスト・フォーカスを見つける。ここでは、TLチャンネルに対して4つの方式をすべて使用し、比較した。ベスト・フォーカスが優先される他のイメージャーとは異なり、ベスト・フォーカス大物レンズとベスト・フォーカス小物レンズは、マトリゲル中のオルガノイドの深さがランダムであるため、平均法やベスト・プレーン法よりもはるかに優れた画質で同様の結果をもたらす（図3）。そのため、計算量が少ないベストフォーカス大物レンズ法をZ投影計算スキームとして採用した。他の同様の複雑な構造については、TL用のこの2D投影スキームを推奨する。

撮影されたTLチャンネルの2Dプロジェクション画像はIN Cartaにエクスポートされ、画像取得中または取得後の解析に利用される。エクスポートされた画像のサイズは、IN Cartaの要件に合わせて自動的に調整され、2000x2000ピクセルのグリッドにタイル状につなぎ合わせられた。

腸オルガノイドと陰窩のディープラーニングモデルの生成

ラベルフリーイメージングは、蛍光ラベルを使用せずに生物学的プロセスを研究するための重要なツールである。しかし、明視野顕微鏡で得られた画像の自動解析は、高いバックグラウンド、陰影効果、破片によるアーチファクトなどの要因のために困難である。これらの問題を克服するために、我々はIN CartaのディープラーニングベースのセグメンテーションツールであるSINAPを使用した。

SINAPを用いて、腸オルガノイドの解析用に2つのモデルを開発した。まず、オルガノイド全体を識別するモデルをトレーニングした。学習セットは、SINAPインターフェース内のブラシツールとポリゴンツールを使用して、オルガノイド領域と背景領域をラベル付けして手動で生成した。オルガノイドと背景のコントラストが良好であったため、気道オルガノイド用に作成したモデルを微調整してモデルを訓練するには、14枚の注釈付き画像で十分であった（図4A）。2番目のモデルは、オルガノイドの陰窩／拡張部のみをセグメンテーションするように訓練された。この場合、より慎重なアノテーションが必要であり、1つ目のモデルを微調整してモデルを訓練するには、23の訓練例で十分であった（図4B）。形状、強度分布、および局所的なコンテキストが、SINAPモデルがオルガノイドコアを含めずに陰窩のロバストなセグメンテーションを達成するための重要な要素であった。モデルが学習されると、各オルガノイド内の陰窩を連結して報告できるようにするため、オルガノイド全体を主要ターゲットに設定し、陰窩をオルガノイドターゲットの1つに設定した（図4C、図5A）。

PhenoglyphsとClassifierによる未熟、中間、成熟オルガノイドの分類

マウス腸管オルガノイドの画像は、1ウェル内のすべての部位をつなぎ合わせた画像を生成するstitched plate取得プロトコルで取得した。腸オルガノイドは3Dであるため、Zスタックモードを選択し、オルガノイド全体をカバーする適切なZ平面のスタックを選択した。CellReporterXpress には、透過光チャンネルに対して異なる Z プロジェクション・オプション（平均、ベスト・プレーン、ベスト・フォーカス・小物レンズ、ベスト・フォーカス・大物レンズ）が用意されている。平均Zプロジェクションは全プレーンの強度を平均化し、ベスト・プレーンはベスト・フォーカスの1プレーンをピッキングし、他の2つのプロジェクションは画像を小さなゾーンに分割し、各ゾーンについて全Zプレーンにわたるベスト・フォーカスを見つける。ここでは、TLチャンネルに対して4つの方式をすべて使用し、比較した。ベスト・フォーカスが優先される他のイメージャーとは異なり、ベスト・フォーカス大物レンズとベスト・フォーカス小物レンズは、マトリゲル中のオルガノイドの深さがランダムであるため、平均法やベスト・プレーン法よりもはるかに優れた画質で同様の結果をもたらす（図3）。そのため、計算量が少ないベストフォーカス大物レンズ法をZ投影計算スキームとして採用した。他の同様の複雑な構造については、TL用のこの2D投影スキームを推奨する。

撮影されたTLチャンネルの2Dプロジェクション画像はIN Cartaにエクスポートされ、画像取得中または取得後の解析に利用される。エクスポートされた画像のサイズは、IN Cartaの要件に合わせて自動的に調整され、2000x2000ピクセルのグリッドにタイル状につなぎ合わせられた。

腸オルガノイドと陰窩のディープラーニングモデルの生成

ラベルフリーイメージングは、蛍光ラベルを使用せずに生物学的プロセスを研究するための重要なツールである。しかし、明視野顕微鏡で得られた画像の自動解析は、高いバックグラウンド、陰影効果、破片によるアーチファクトなどの要因のために困難である。これらの問題を克服するために、我々はIN CartaのディープラーニングベースのセグメンテーションツールであるSINAPを使用した。

SINAPを用いて、腸オルガノイドの解析用に2つのモデルを開発した。まず、オルガノイド全体を識別するモデルをトレーニングした。学習セットは、SINAPインターフェース内のブラシツールとポリゴンツールを使用して、オルガノイド領域と背景領域をラベル付けして手動で生成した。オルガノイドと背景のコントラストが良好であったため、気道オルガノイド用に作成したモデルを微調整してモデルを訓練するには、14枚の注釈付き画像で十分であった（図4A）。2番目のモデルは、オルガノイドの陰窩／拡張部のみをセグメンテーションするように訓練された。この場合、より慎重なアノテーションが必要であり、1つ目のモデルを微調整してモデルを訓練するには、23の訓練例で十分であった（図4B）。形状、強度分布、および局所的なコンテキストが、SINAPモデルがオルガノイドコアを含めずに陰窩のロバストなセグメンテーションを達成するための重要な要素であった。モデルが学習されると、各オルガノイド内の陰窩を連結して報告できるようにするため、オルガノイド全体を主要ターゲットに設定し、陰窩をオルガノイドターゲットの1つに設定した（図4C、図5A）。

PhenoglyphsとClassifierによる未熟、中間、成熟オルガノイドの分類

腸オルガノイドの成長と成熟は明視野顕微鏡でモニターできる。通常、培養3-5日後にオルガノイドは伸長し始め、7日目にはより成熟した複雑な多葉構造（複数の芽を持つ）が見られるようになる。培養中の成熟腸オルガノイドと未熟腸オルガノイドの数を定量化するために、機械学習ツールPhenoglyphsを用いて、オルガノイドをその表現型に基づいて分類した。

Phenoglyphsでは、対物レンズの形態、相対位置、強度、テクスチャーを含む幅広い測定値から選択することができる。Phenoglyphsの分類ルールを定義するために、専用の機械学習アルゴリズムによって表現型クラスタの予備セットを特定した。次に、関心のある表現型（未熟、中間、成熟）を表すクラスタを選択した。各クラスタ内の不均一性を減らすために、過剰な数のクラスタを推奨する。われわれの場合、当初は3つの表現型分類しか期待していなかったにもかかわらず、20クラスタを要求した。

測定前は、複雑であればあるほど陰窩が多くなるため、陰窩に関連する測定が分類に最も寄与するはずだと予想していた。予想通り、これらの測定値は未熟、中間、成熟オルガノイドを分類するのに重要なものとしてランク付けされた（図5B）。次に、上位20の尺度を用いてモデルを訓練し、その結果を表1に示した。必要に応じて相関の閾値と上位Nを変更してもよい。仕様として、選択された尺度の数を4 * L（Lはクラス数）に近くなるように選択し、相関閾値を90に設定して冗長な尺度を排除し、現在のデータセットに対して特異性が高すぎるモデルが生成されないようにする。オルガノイドの代表的な画像を図5Dに示す。

表1. Phenogplyphsと分類器に基づく分類結果

あるいは、この分類器は、個々の尺度に依存し、下限値/上限値をユーザーが手動で定義する必要がある、より単純でわかりやすい分類として使用することもできる。この場合、クラスを指定する尺度として、オルガノイドあたりのクリプト数（セルあたりのオルガネラ数）を選んだ。図5Cでは、クリプト数が0のオルガノイドを未成熟オルガノイドとしてグループ化し、クリプト数が1～6のオルガノイドを中間オルガノイドとしてグループ化したが、これはPhenoglyphsが生成した統計量に近い（表1）。2つ以上の特徴が分類を支配するような複雑なシナリオでは、Phenoglyphsが好ましいアプローチである。ウェル別、FOV別、クラス別の要約結果と単一標的データは.csvファイルとしてエクスポートでき、さらなる分析に使用できる。

結論

• ImageXpress Picoシステムは、ガイド付きワークフローによる高速で便利なハイコンテントイメージャーを可能にします。
• ISINAPは、従来の画像解析アルゴリズムでは困難であった対物レンズのセグメンテーションを可能にする強力なツールです。
• Phenoglyphsは標識不要オルガノイドのロバスト性分類を可能にする。