Application Note 自動細胞イメージングを用いた
アポトーシスの解析

はじめに

Matthew Hammer and Oksana Sirenko博士｜アプリケーションサイエンティスト｜モレキュラーデバイス

アポトーシスは、多細胞生物において生じるプログラムされた細胞死のプロセスです *1 *2。この過程では、生化学的なイベントにより、細胞の形態変化と死が特徴的に引き起こされます。形態的な変化には、細胞の収縮、核の断片化、クロマチンの凝縮、染色体DNAの断片化、mRNAの分解などが含まれます。アポトーシスは高度に制御されたプロセスであり、飢餓、感染、低酸素状態、酸化ストレスなど、さまざまなストレス因子に応答して内因性経路を介して開始されることがあります。この経路では、ミトコンドリアの損傷がアポトーシスの開始に重要な役割を果たします。一方、外因性経路では、腫瘍壊死因子受容体ファミリーを介したシグナル伝達など、外部からの刺激によってアポトーシスが誘導されます。いずれの経路においても、カスパーゼ酵素の活性化を通じて細胞死が引き起こされます。アポトーシスの制御異常は、がんをはじめとするさまざまな疾患との関連が示唆されています。本稿では、自動細胞イメージングを用いたアポトーシス検出のための細胞ベースアッセイについて紹介します。

材料

• HeLa細胞（ATCC）
• HeLa培地
• DMEM：CellGro、L-グルタミン入り（Corning）
• 10% FBS (BenchMark™; Gemini)
• 1% ペニシリン/ストレプトマイシン
• スタウロスポリン（Sigma）
• マイトマイシンC（Sigma）
• カンプトテシン（Sigma）
• EarlyTox Caspase-3/7 NucView 488アッセイキット（モレキュラーデバイス P/N R8348）
• 96ウェル黒色透明底マイクロプレート（Greiner）
• ImageXpress Pico 自動細胞イメージングシステムおよび CellReporterXpress自動画像取得・解析ソフトウェア（モレキュラーデバイス）

方法

HeLa細胞を用いたアポトーシス誘導実験の概要 ヒト子宮頸がん由来の細胞株であるHeLa細胞を、黒色・透明底の96ウェルGreinerマイクロプレートに1ウェルあたり5,000細胞の密度で播種し、37°C、5% CO₂環境下で一晩培養しました。翌日、アポトーシスを誘導するために、抗がん剤であるスタウロスポリン、マイトマイシンC、カンプトテシンをそれぞれ異なる濃度で4つのウェルずつ処理しました。各化合物の最高濃度は、スタウロスポリンが10 µM、マイトマイシンCが200 µM、カンプトテシンが100 µMでした。処理から18時間後、細胞はEarlyTox™ Caspase-3/7 NucView 488染色液およびEthidium Homodimer IIIで30分間染色され、最終濃度はそれぞれ5 µMおよび3 µMとなりました。その後、Hoechst 33342核染色液を各ウェルに添加し、最終濃度6 µMで染色を行いました。染色後、細胞は再び37°C、5% CO₂のインキュベーターに戻され、15分間インキュベートされました。

EarlyTox Caspase-3/7 NucView 488アッセイキット

Caspase-3とCaspase-7はアポトーシスの実行段階で活性化されるプロテアーゼです。EarlyToxキットのCaspase-3/7 NucView 488基材は、インタクト細胞内のCaspase-3/7活性を検出するために使用されます。この基質は、Caspase-3/7 DEVD認識配列に結合した蛍光性DNA色素からなります。最初は無蛍光ですが、基質は細胞膜を透過して細胞質に入ります。アポトーシス細胞では、Caspase-3/7が基材を切断し、細胞核に移動してDNAに結合する高親和性DNA色素を放出します。500 nmで励起すると、530 nmで明るい緑色の蛍光を放出し、Caspaseの活性化レベルを評価するのに使用できます。全細胞数の評価にはHoechst 33342核染料を、死細胞（外膜が破壊された細胞）の数にはEthidium Homodimerを用いました。

自動細胞イメージングによるアポトーシス評価

染色後、ImageXpress® Pico自動細胞イメージングシステムを用い、対物レンズ10Xで生細胞をイメージングしました。画像は、DAPI、FITC、TRITCチャンネルを用い、それぞれ20、500、50msの露光時間で、ウェルあたり1部位ずつ取得しました。図1は、コントロール細胞と、0.3 µM staurosporineと10 µM mitomycin Cで処理した細胞の画像です。

Hoechst核染色は青色、アポトーシス核は緑色、死細胞の核は赤色で示します。CellReporterXpress自動画像取得・解析ソフトウェアのアポトーシス解析プロトコルとフライでの画像取得を併用し、カスパーゼ染色で示されるアポトーシス細胞の数と割合を評価しました。さらに、Ethidium Homodimer染色も死細胞の数と割合を検出するために使用することができ、Hoechst染色は全細胞を定義するために使用しました。その結果、アポトーシスと細胞死誘導の濃度反応曲線が、測定されたEC₅₀値とともに図2に示されました。注目すべきことに、強力なアポトーシス誘導剤として知られるキナーゼ阻害剤スタウロスポリンのEC₅₀は、異なる細胞メカニズム（生還元的アルキル化）によって抗がん効果を誘導するマイトマイシンCのEC₅₀よりも約100倍低かったです。

結論

EarlyToxアッセイキットは、疾患の生物学的製剤の研究、抗がん剤の評価、細胞の健康状態のモニタリングに有用です。これは、アポトーシスの評価と定量におけるImageXpressPicoシステムとCellReporterXpressソフトウェアの有用性を示すものです。

参考文献

1. Green, Douglas (2011). Means to an End: Apoptosis and other Cell Death Mechanisms. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN 978-0-87969-888-1.
2. Alberts, Bruce; Johnson, Alexander; Lewis, Julian; Raff, Martin; Roberts, Keith; Walter, Peter (2008). Molecular Biology of the Cell. (5th ed.). Chapter 18. Apoptosis: Programmed Cell Death Eliminates Unwanted Cells. Garland Science. p. 1115. ISBN 978-0-8153-4105-5.
3. Karam, Jose A. (2009). Apoptosis in Carcinogenesis and Chemotherapy. オランダ： Springer. ISBN 978-1-4020-9597-9.
4. Verweij J1, Pinedo HM. Mitomycin C: mechanism of action, usefulness and limitations. Anticancer Drugs. 1990 Oct;1(1):5-13.