Application Note SpectraMax iD3およびiD5リーダーでの
カルシウム動員アッセイを可能にする
最適化ワークフローの開発

はじめに

マーク・マクペイト博士｜アプリケーション・サイエンティスト｜モレキュラー・デバイス
サイモン・リドフォード｜アプリケーション・サイエンティスト・マネージャー｜モレキュラー・デバイス

進行中の研究ニーズに応じて研究室の要件が変化することが多いため、吸光度、発光、蛍光など複数の検出モードを提供するマルチモードマイクロプレートリーダーが必要不可欠となっている。アップグレードが容易なリーダーを持つことも重要である。例えば、細胞ベースのアッセイを容易に実行するための分注オプションを提供することで、柔軟性、コスト削減、ベンチスペースの削減が保証され、複数の専用装置を購入する必要がなくなる。

生化学的アッセイから細胞ベースのアッセイへの移行に関心を持つ研究者は、通常、各プレートからできるだけ多くの情報を引き出したいと考えています。一般的な例としては、GPCRを介したカルシウムシグナルの速度論的検出やイオンチャネル活性が挙げられます。通常、これらのアッセイでは、シグナルは数秒で最大値に達し、減衰するため、化合物の注入と同時にリアルタイムでモニターする必要があります。

ここでは、デュアルインジェクターシステムを搭載したSpectraMax® iD3およびiD5マルチモードマイクロプレートリーダーを使用して、細胞内カルシウムの変化をモニターする情報量の多い蛍光ベースのアッセイを開発する方法を示します。さらに、洗浄不要のFLIPR® Calcium 6および6-QFアッセイキットを使用することで、アッセイシグナルウィンドウが拡大し、アッセイの堅牢性が向上し、接着細胞および浮遊細胞の両方で作業するために必要な柔軟性が得られます。

SpectraMax iD3およびiD5リーダーで2つのアッセイを開 発し、業界標準のFlexStation® 3 Multi-Mode Microplate Readerで行った同じアッセイと比較しました。最初に、FLIPR Calcium 6 キットを用いて、ヒト星細胞腫細胞株 1321N1 のムスカリン性アセチルコリン受容体を調べるための接着細胞アッセイを確立した。次に、ヒト単球懸濁細胞株であるTHP-1細胞に着目し、FLIPRカルシウム6-QFアッセイを用いてプリン作動性P2Y受容体の研究を可能にするシンプルなワークフローを開発した。

材料

試薬

• 1321N1細胞 (ECACC cat. #86030402)
  ⚪︎培地 DMEM＋2mMグルタミン＋10％ウシ胎児血清（FBS）
• THP 1細胞（ECACCカタログ番号88081201）
  ⚪︎培養培地： RPMI 1640 + 2mM グルタミン + 10%ウシ胎児血清 (FBS)
• カルシウムとマグネシウムを含むハンクス平衡塩類溶液（HBSS）（Sigma-Aldrichのカタログ番号#55037C）
• 塩化カルバモイルコリン（Sigma-Aldrich cat.）
• 塩化アセチルコリン（Sigma-Aldrich cat.）
• アトロピン（Sigma-Aldrich cat.）
• ピレンゼピン二塩酸塩（Sigma-Aldrich cat.）
• アデノシン5′-三リン酸（ATP）二ナトリウム塩（Sigma-Aldrich cat.）
• ウリジン5′-三リン酸（UTP）二ナトリウム塩（Sigma cat.）
• プロベネシド（AAT Bioquest cat.）
• FLIPRカルシウム6アッセイキット（Molecular Devices cat.）
• FLIPRカルシウム6-QFアッセイキット（Molecular Devices社cat. #R8192）

装置

• SpectraMax iD3およびiD5マルチモードマイクロプレートリーダー（Molecular Devices社製）
  ⚪︎SpectraMax インジェクターカートリッジ（Molecular Devices 社、商品番号 0200-7029）
• FlexStation 3マルチモードマイクロプレートリーダー（Molecular Devices社製）
  ⚪︎8チャンネルピペッターヘッドキット（Molecular Devices社、型番：0200-6182）

マイクロプレート

• CellBIND 96 ウェル黒色壁、透明底プレート、滅菌済み (Corning 社 cat. #3340)
• Greiner 96-ウェルプレート、丸底透明ウェル、無菌 (Greiner cat. #650201)

方法

細胞調製

1321N1 "assay ready "凍結細胞を急速解凍し、96ウェル黒壁透明底プレートに、200μLの補充DMEM培地中で、1ウェル当たり2×104細胞ずつ播種した。37℃、湿度95％、CO2 5％で一晩培養した。

THP-1細胞は、37℃、95％湿度、5％CO2のRPMI培地中で懸濁培養した。使用当日、各アッセイに必要な細胞数を50mL遠心チューブに分注し、1,000rpmで5分間スピンダウンした。

色素負荷

1321N1細胞の場合、培地を除去し、200μLのFLIPRカルシウム6試薬（プロベネシド含有）を各ウェルに添加した。その後、プレートを37℃、5% CO2で1時間45分間インキュベートし、その後室温で15分間インキュベートした。

THP 1細胞については、遠心後、細胞をFLIPRカルシウム6-QF試薬（プロベネシドを含む）に1.25 x 106 cells/mLで再懸濁した。カルシウム6-QF試薬はマスキング色素を使用しないため、ウェル底部の単層ではなく、真の懸濁状態にある細胞のアッセイに理想的です（図1）。細胞を37℃で2時間、振盪水浴中でインキュベートし、アッセイ2分前に180μLの細胞懸濁液を各マイクロプレートウェルに分注した。

アッセイプロトコル

アゴニスト濃度反応曲線は、SmartInject™ テクノロジー搭載 SpectraMax インジェクターシステムを搭載した SpectraMax iD3 または iD5 リーダーで、一度に 1 濃度のアゴニストを測定しました。各濃度反応曲線について、キャリーオーバーを最小にするため、アッセイを低濃度から高濃度へと実行した。インジェクターは化合物でプライムされ、次に色素担持細胞プレートが装置にセットされ、各濃度について3重ウェルを用いてアッセイが実行された。1321N1 細胞では、SmartInject™ テクノロジーを使用して各ウェルに 5 倍濃縮化合物を 50μL 注入しました。設定、図2を参照。

THP-1細胞では、FLIPRカルシウム6-QF試薬中の細胞180 μLをマイクロプレートの3ウェルにピペッティングし、1321N1細胞の化合物添加と同様のプロトコルを用いたが、注入アーチファクトを最小限に抑えるため、10Xアゴニストの添加量を20 μLと少なめにした。その後、インジェクターを逆回転させてラインから化合物を除去し、次の高濃度の化合物でプライムした。新しいプレートセクションを作製し、次の3連ウェルセットでアッセイを実施した（図3）。

このプロセスを化合物濃度ごとに繰り返した。装置とインジェクターの設定を定義するために、SoftMax Pro 7.1 ソフトウェアの Acquisition Plan Editor を使用した（図 2）。

アンタゴニスト試験（1321N1 細胞のみ）のために、細胞培養培地を除去し、ウェルあたり 180 μL の FLIPR Calcium 6 アッセイ試薬で置換した。細胞を37℃で105分間インキュベートした後、20μLの10倍濃縮アンタゴニストを添加し、さらに室温で15分間平衡化した。次にアゴニスト（5倍濃縮）を、インジェクター1またはインジェクター2を用いて、あらかじめ決められたEC80濃度で50μLずつ3回に分けて添加した。

FlexStation 3リーダーでも同様の色素負荷とアンタゴニ ストのインキュベーションプロトコールが用いられたが、 内蔵の8チャンネルピペッターを用い、コンパウンドプレートか ら全7濃度のアゴニストとバッファーコントロールをセ ルプレートのカラムの各ウェルに同時に、あるいはアンタゴニ スト研究ではアゴニストのEC80濃度を8反復して供給した。

結果

デュアルインジェクターにアップグレードしたSpectraMax iD3およびiD5リーダーを用いることで、接着細胞株と浮遊細胞株の両方において、確実なアゴニストおよびアンタゴニストの濃度反応曲線が得られた。固着細胞 1321N1 の速度論的データは、ミディアムスループットの FlexStation 3 リーダーおよびハイスループットの FLIPR® Penta High-Throughput Cellular Screening System で得られたデータと一致しており、3つのシス テムすべてで同様の最大応答が得られた（図 4）。懸濁状態のTHP-1細胞を用いた場合にも同様の状況がみられた（図6）。

接着した1321N1細胞では、細胞外のバックグラウンドを低減する新しいマスキング技術を搭載したFLIPR Calcium 6試薬を使用した。ムスカリン受容体リガンドであるアセチルコリン、カルバコール、アトロピン、ピレンゼピンに対する反応を測定した。アゴニストEC50値とアンタゴニストIC50値の算出には、SoftMax Proソフトウェアに組み込まれた4パラメータのロジスティックカーブフィットとカスタムデータ削減を用いた（図5）。

SpectraMax iD3およびiD5リーダーで得られたEC50お よびIC50の計算値を、FlexStation 3リーダーおよび FLIPR Pentaシステムで得られた同等のデータとともに表 1に示す。3つの装置すべてに有意差は認められなかった。

表1. カルシウム6色素を負荷した1321N1細胞から得られたアゴニストとアンタゴニストのデータ。すべてのデータはμM単位で、n≧3の独立実験である。ただし、*のラベルが付いたデータはn＝2である。FLIPR Pentaシステムのデータは、以前の研究で作成されたものである。

これまでは、浮遊細胞の場合、マイクロプレートの底に色素を負荷した細胞の単層を作り、次にリガンドを穏やかに加えて、細胞層に悪影響を与えることなくカルシウム反応を開始させるという従来の方法を用いていた。アッセイ準備時間と細胞培養消耗品を節約しながらも、確実なシグナルを発生させるために、カルシウム6-QFオプションの使用に基づいたワークフローを開発した。これにより、クエンチャーの干渉を受けずに細胞を懸濁状態に保つことができ、アッセイ量を調節して混乱を最小限に抑えながらも、良好なシグナルウィンドウを得ることができた（図6参照）。4パラメータカーブフィットを用いてアゴニストEC50値を算出した（図7）。

UTPとATPのEC50の計算値を、FlexStation 3リーダーおよびFLIPR Pentaシステムで得られた同等のデータと合わせて表2に示す。3つの装置で大きな違いは観察されなかった。

表2. カルシウム6-QF色素負荷THP-1細胞から得られたアゴニストEC50値。データはすべてμMで、n≧3の独立実験である。

結論

SpectraMax iD3およびiD5リーダー、SmartInject テクノロジー搭載SpectraMax インジェクターカートリッジ、およびFLIPRカルシウム6および6-QFアッセイキットを用いて、接着細胞株と浮遊細胞株の両方において、頑健で再現性の高いカイネティクスアッセイを開発できることを実証した。

マスキング技術を用いたFLIPR Calcium 6試薬を用いた接着性1321N1細胞では、アゴニストとアンタゴニストの両方のデータが、FlexStation 3リーダーやFLIPR Pentaシステムなどの中・高スループットシステムで得られたデータとほぼ一致している。さらに、THP-1細胞については、細胞内Ca2+アッセイを開発する際に懸濁状態の細胞を使用できるように、FLIPR Calcium 6アッセイのクエンチフリー（QF）製剤を用いてiD3およびiD5リーダーで新しいワークフローを開発することが可能であることを初めて示した。

さらに、SpectraMax iD3 および iD5 リーダーで得られたデータは、FlexStation 3 リーダーおよび FLIPR Penta システムで得られたデータとよく相関している。リーダは手頃な価格でアップグレード可能なシステムであり、研究者がすぐにELISAや細胞生存率アッセイを実施できる。インジェクターを追加するだけで、より高スループットのシステムで開発されたものに匹敵する、情報量の豊富な細胞ベースのキネティックアッセイを開発することができる。