Application Note iPS細胞による神経突起伸長アッセイで
神経毒性を解析

Oksana Sirenko, PhD｜シニアリサーチサイエンティスト｜モレキュラーデバイス｜カリフォルニア州サニーベール

はじめに

環境中に未検証の化学物質が増加していることへの懸念が高まっており、ヒトの健康、特に神経発達に影響を与える可能性のある化学物質を特定するための信頼性が高く効率的なスクリーニングツールの開発が急務となっています *1。

私たちは、発達中の神経系に悪影響を及ぼす可能性のある化合物の活性を特徴づけるスクリーニング法として、神経突起伸長アッセイを評価しました。このアッセイは、ニューロンが神経突起を伸長して完全な神経ネットワークを形成するという、神経系発達における重要なプロセスのモデルとして有用であるため選択しました *2。このプロセスの阻害は、ヒトやげっ歯類に悪影響を及ぼす可能性があり、未成熟、発達中、成熟した神経突起が化学物質毒性の標的となることが示唆されています *3。

神経突起伸長アッセイは主に発達神経毒性の評価に使用されますが、神経突起の収縮を指標として神経変性を評価することも可能です。さらに、このアッセイは成人ニューロンの神経可塑性評価にも関連する可能性があります *4。スクリーニングアッセイでは、総神経突起伸長量が最も一般的な指標として報告されます *1,5。自動化イメージングを活用することで、総分岐数や総突起数など、化合物が神経突起伸長を阻害するさまざまな様式を包括する追加特徴のマルチパラメーター評価が可能になります *6,*7。

材料

• ImageXpress®Nano自動イメージングシステムとCellReporterXpress®ソフトウェア（モレキュラーデバイス）
• iCell ® Neurons (Cellular Dynamics International)
• ポリ-d-リジンプレコート384ウェルプレート（Corning Life Sciences）
• ラミニン（Sigma-Aldrich）
• パラホルムアルデヒド（Sigma-Aldrich）
• ウシ胎児血清 (Sigma-Aldrich)
• βチューブリンIII (TUJ-1) (BD Biosciences)
• Hoescht (ThermoFisher Scientific)
• 抗ß-チューブリン抗体（BD Biosciences）
• カルセインAM（ThermoFisher Scientific)

iPSCベースの神経突起伸長アッセイによる神経毒性化合物の同定

本研究では、Cellular Dynamics International（CDI）から提供された、分裂後のGABA作動性およびグルタミン酸作動性ニューロンの混合集団で構成されるヒトiPS細胞由来ニューロン（iCell Neurons）と培養メディアを使用しました。これらのニューロンは、βIIIチューブリンおよびMAP2の神経マーカーに陽性の神経突起ネットワークを形成する、完全に分化・精製された細胞集団として提供されました。細胞は凍結状態で受け取り、CDI推奨プロトコールに従って解凍・播種しました。細胞はポリ-D-リジンでコートされた384ウェルプレートに播種し、3.3 μg/mLのラミニンで処理しました。化合物処理前に、各ウェルに7,500細胞を播種し、iCell Neurons Maintenance Mediumで48時間維持しました。神経突起ネットワークは播種後約24時間で形成を開始し、培養10～12日で複雑さが増します。播種後48時間で神経突起伸長を評価しましたが、同時に神経突起収縮も起こっていた可能性があります。化合物は6段階の濃度範囲（0.3、1.0、3.0、10.0、30.0、100 μM）で重複して試験しました。各プレートには複数のDMSOコントロール（n=16）と未処理コントロール（n=16）を含めました。アッセイ内で溶媒の影響を評価するため、最大0.3%のDMSOを使用しました。細胞は37°C、5% CO₂で72時間化合物に曝露しました。

次に、培地を除去し、細胞を4%パラホルムアルデヒドで2時間固定しました。その後、PBSに1%ウシ胎児血清を加えた0.01%サポニンで透過処理しました。次に、β-チューブリンIII（TUJ-1）に対するAF488結合抗ヒトマウス抗体（1:100希釈）とHoechst（2 μg/mL）で3時間インキュベートしました。β-チューブリンは神経突起伸長のマーカーとして、またニューロン細胞体のカウントにも使用しました。インキュベーション後、染色液をPBSに置換しました。代替法として、Calcein AM（0.5 μM）とHoechst（2 μM）で30分間染色するライブセル法も可能です。384ウェルフォーマットアッセイの播種密度最適化およびプロトコールの詳細はSirenkoらの報告に記載されています *6。

図1. コントロール細胞のβ-チューブリン（緑）染色画像とソフトウェア解析トレース
iCell Neuronsを5日間培養後、AF488結合抗β-チューブリン（TUJ-1）抗体（1:100）で固定・染色しました。画像はImageXpress Nanoシステムで10X Plan Fluor対物レンズとFITCチャンネルを使用して取得しました。画像はCellReporterXpressソフトウェアのNeurite Tracing解析アルゴリズムで処理しました。右側の解析マスクは、神経突起伸長（緑）と細胞体（青）を示しています。

各ウェルの画像は ImageXpress Nano 自動イメージングシステムを使用し、10X Plan Fluor対物レンズで取得しました。384ウェルプレートの各ウェルで単一サイトから10X画像を1枚撮影しました。10X対物レンズは、神経突起ネットワークや細胞内構造を識別するのに十分な解像度を提供し、画像あたり約500～1,000細胞を含み、ウェル全体の約1/4をカバーしました。画像取得後、すべての画像解析は CellReporterXpressソフトウェアを使用して行いました。このソフトウェアには、神経突起伸長および生存率評価のための画像処理モジュールが含まれています。画像処理の例として、図1には神経突起画像の拡大例と対応する解析マスクを示し、図2にはDMSO処理ニューロンと化合物処理ニューロンの画像にソフトウェアのトレースオーバーレイを示しています。

図2. β-チューブリン（緑）とHoechst（青）の合成画像、コントロール細胞および化合物処理細胞の解析トレース
iCell Neuronsを48時間培養後、化合物で72時間処理し、Hoechst（2 μM）とAF488結合抗TUJ-1抗体（1:100）で固定・染色しました。画像はImageXpress Nanoシステムで10X Plan Fluor対物レンズ、DAPIおよびFITCチャンネルを使用して取得しました。画像はCellReporterXpressソフトウェアのNeurite Tracing解析アルゴリズムで処理しました。化合物処理ニューロンでは神経突起ネットワークの破壊と細胞死が観察されました。

神経突起ネットワークの複雑性をマルチパラメーター画像解析で定量化

化合物処理によるニューロンネットワーク形成の阻害は用量依存的に観察されました（図3）。本実験で取得した画像の定量解析では、培養ニューロンの形態的特徴とネットワークの複雑性を評価するために複数のパラメーターを導出しました。
具体的には、神経突起伸長は以下の指標で特徴づけました：
・総伸長量（例：総伸長長または細胞あたり平均伸長長）
・神経突起プロセス数（例：総プロセス数および細胞あたり平均プロセス数）
・分岐数（例：総分岐数および細胞あたり平均分岐数）
実験全体で細胞播種と神経突起伸長は均一だったため、統計解析には画像ごとの総特徴数（分岐とプロセス）を使用しました。さらに、各画像内のβ-チューブリン（TUJ-1陽性）またはCalcein AM陽性細胞体数を定量化し、化合物による細胞死を評価しました。細胞あたりの伸長長やプロセス・分岐数も測定しましたが、冗長性のため統計解析には使用しませんでした。

図3. 総神経突起伸長長および総分岐数の濃度反応曲線
神経突起ネットワークの破壊および化合物処理後に観察された細胞死は、CellReporterXpressソフトウェアの神経突起伸長解析アルゴリズムを使用して定量化しました。用量依存的な効果は、総伸長長および分岐数の減少として示されています。ここでは、選択された化合物について、これら2つの読み出しを用いた4パラメータカーブフィットを示します。EC₅₀値は表1に記載されています。

化合物の毒性効果は、神経突起伸長の50%阻害に必要な化合物濃度であるEC₅₀値で比較できます。EC₅₀値は、神経突起伸長、分岐数、プロセス数、生存細胞体数の値に基づき、4パラメータカーブフィットから導出しました。図3は、総神経突起ネットワーク長（総伸長）および総分岐数の濃度依存曲線を示しています。これらの測定により、有効な毒性濃度を定義し、化合物の神経毒性の可能性を比較し、さらなる毒性評価の優先順位を決定することができました。

複数パラメーターの用量反応評価

濃度反応曲線はHillモデルを用いて評価し、EC₅₀濃度値を導出しました。異なる読み出しのEC₅₀値は表1に示されています。試験した16種類の化合物のうち、11種類の処理で神経突起伸長の減少と分岐数・プロセス数の減少が認められました。このうち6種類の化合物では細胞体数の減少も観察されました。他の5種類の化合物は比較的軽微な影響しか示さなかったため、EC₅₀値は算出しませんでした。総分岐数および総伸長の阻害に対するEC₅₀値は高い一致を示しました。選択された処理では、神経ネットワークの破壊は細胞毒性効果よりも低濃度で明らかでした。したがって、細胞体数の減少に対するEC₅₀値は、これらの化合物による神経突起伸長阻害のEC₅₀値よりも高い傾向がありました。

※試験化合物の神経毒性効果に対するEC₅₀値（µM）は総神経突起伸長長および分岐数を読み出しとして測定したEC₅₀値です。誤差範囲は、カーブフィットから定義されたパラメータ推定の標準誤差です。
注釈：未定義の標準誤差は、カーブフィットが収束したものの、パラメータ推定の不確実性を決定できなかったことを示します。「>100」 は、試験した最高濃度（100 µM）で毒性効果（神経突起伸長や分岐数の減少など）が観察されたものの、EC₅₀値が算出されなかったことを意味します。「効果なし」 は、試験した最高濃度（100 µM）でも明確な影響が観察されなかったことを意味します。濃度反応曲線は、総神経突起伸長、総分岐数、総プロセス数、総細胞体数について計算しました。EC₅₀値は、各化合物処理に対してHillモデルを用いた4パラメータカーブフィットから導出しました。

結論

神経突起伸長アッセイは、大規模な化学物質ライブラリーにわたる神経毒性評価に適した、効率的かつ効果的なハイスループットスクリーニング実験です。このスクリーニングにより、ヒトに神経毒性を誘発する可能性のある化合物を迅速に特定・評価し、優先順位を付けることができます。また、このアッセイは、ニューロン発達に対して神経保護作用や刺激作用を持つ可能性のある化合物の評価にも使用できます。ImageXpress Nanoシステムは、ハイスループットスクリーニングキャンペーンに適した高度な表現型アッセイを実施するための効率的なツールです。

参考文献

1. Radio, N.M., Breier, J.M., Reif, D.M., Judson, R.S., Martin, M., Houck, K.A., et al., 2015. Use of neural models of proliferation and neurite outgrowth to screen environmental chemicals in the ToxCast Phase 1 library. Appl. *In Vitro Toxicol.*1 (2), 131–139.
2. Harrill, J.A., Robinette, B.L., Freudenrich, T., Mundy, W.R., 2013. Use of high content image analyses to detect chemicalmediated effects on neurite sub-populations in primary rat cortical neurons. Neurotoxicology 34, 61–73.
3. Radio, N.M., Mundy, W.R., 2008. Developmental neurotoxicity testing in vitro: models for assessing chemical effects on neurite outgrowth. Neurotoxicology 29, 361–376.
4. Lee W-CA, Huang H, Feng G, Sanes JR, Brown EN, So PT, et al. 2006. Dynamic remodeling of dendritic arbors in GABAergic interneurons of adult visual cortex. *PLoS Biol.*4(2): e29.
5. Stiegler, N.V., Krug, A.K., Matt, F., Leist, M., 2011. Assessment of chemical-induced impairment of human neurite outgrowth by multiparametric live cell imaging in high-density cultures. *Toxicol. Sci.*121, 73–87.
6. Sirenko, O., Hesley, J., Rusyn, I., Cromwell, E.F., 2014. High-content high-throughput assays for characterizing the viability and morphology of human ipsc-derived neuronal cultures. *Assay Drug Dev. Technol.*12, 536–547.
7. Ryan, K.R., Sirenko, O., Parham, F., Hsieh, J.H., Cromwell, E.F., Tice, R.R., Behl, M., 2016. Neurite outgrowth in human induced pluripotent stem cell-derived neurons as a high-throughput screen for developmental neurotoxicity or neurotoxicity. *Neurotoxicology.*53: 271-81.
8. iCell Neurons | Cellular Dynamics. (n.d.). Retrieved June 01, 2017, from http://www.cellulardynamics.com/products/neurons.html

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