Application Note 組織学的に染色され蛍光標識された
組織の自動スライドスキャン
- 低倍率で高速スキャンし、重要な関心領域を特定
- 重なり合った大きな画像を自動的につなぎ合わせる
- 組織染色または蛍光標識された組織を画像化
- スライドイメージングを5分以内にセットアップ
PDF版（英語）
はじめに
細胞ベースアッセイ用のマルチウェルプレートフォーマットの人気は高まっているが、顕微鏡スライドの自動イメージングに対する需要も高まっている。スライドアッセイの用途としては、様々な疾患や正常状態を表す組織スライスの染色と画像イメージング、アレイ形式での細胞ベースアッセイの実施、プレートベース形式に移行する前にスライド上で既に開発されているアッセイのテストなどがあります。
スライドは性質が多様であるため、マルチウェルプレート用に設計されたハイコンテントシステムでのイメージングが困難な場合が多い。スライドが予測可能なフォーマット（印刷されたRNAiや抗体アレイなど）で作成されていない限り、通常、高解像度でスキャンする特異性を目視で判断する必要があります。高倍率でスライド全体をスキャンすることは望ましいが、通常、時間とデータの保存に負担がかかる。
ImageXpress®スクリーニングシステムは、選択的なスライドスキャンを容易にし、組織染色または蛍光標識された組織上の関心領域のスキャンと高解像度イメージングの自動ワークフローを迅速に作成することができます。当社のシステムには、MetaXpress® ハイコンテント画像取得・解析ソフトウェアが含まれており、スライド操作に特化したユーザーフレンドリーなツールを提供します。
このノートでは、MetaXpress® ソフトウェアのスライド領域取得アプリケーションについて説明します。このアプリケーションは、スライドから重なり合った画像を自動的に取得し、つなぎ合わせることができます。
シンプルなワークフローで低倍率と高倍率を素早くキャプチャ
一般的なワークフローとしては、まずスライド全体（または複数のスライド）を低倍率でスキャンします。その後、より高解像度のイメージングを行う領域を自動または手動で選択し、お客様の仕様に合わせてイメージングを行います。ImageXpressシステムは、自動化に適した3スライドホルダーを使用することで、低解像度スキャンと、スライドライブラリー全体の特異性領域の高解像度スキャンの両方を自動で行うことができます。
| スライド領域取得の設定 | |
|---|---|
| ステップ | 説明 |
| 1. 荷重スライド | 準備したスライドをカバースリップが下になるようにスライドホルダーにセットする。ImageXpressシステムにセットする。カバースリップのないスライドも同様に画像化します。 |
| 2. スライドのプレビュー | 次へ スライドスキャン > プレビュースキャンの実行 を選択する。透過光（利用可能な場合）や核染色用のDAPIなど、短時間の露光でサンプル全体を観察できる低倍率（1倍～4倍）と単一波長を選択します。単一の焦点位置でスライド全体を撮像することで、時間を節約できます。 |
| 3. 地域の定義 | 高倍率でスキャンしたい領域の周囲に領域を描く。次へ スライドスキャン > スキャン領域の作成 をクリックし、撮影領域を変換します。 |
| 4. スキャンパラメーターの定義 | 倍率、波長、露光時間、レーザーベースまたは画像ベースのオートフォーカスを含む高解像度画像パラメータを選択します。 |
| 5. スキャン | 設定を保存し、スキャンを開始します。 |
図 1. ImageXpressシステムでスライドを取得するための簡略化されたワークフロー。
スライド領域の取得を5分以内にセットアップ
| TMAスライド | ラット脳スライド | 腎臓スライド | |
|---|---|---|---|
| 染色 | 3 | 3 | 3 |
| # 波長数 | 3 | 3 | 3 |
| # 領域数 | 30 | 1 | 1 |
| # 領域あたりのサイト数 | 16 | 450 | 200 |
| 総撮影枚数 | 1440 | 1350 | 600 |
| セットアップに要した時間（低磁力域とROI） | 5分 | 3分 | 3分 |
| 撮影時間（高磁力） | 30分 | 41分 | 19分 |
| 解析時間 | 35分 |
28分 |
該当なし |
*メタエクスプレスパワーコア使用
表1. スライド画像取得の詳細。Time to set upに記載されている時間は、必要な実習時間のみである。スライド上の関連組織の高倍率画像を撮影するために必要なハンズオンの時間は非常に限られている（最大5分）。
高倍率での画像取得とその後の解析は、すべて完全に自動化されており、手を動かす必要はありません。比色分析または蛍光イメージングのどちらにも柔軟に対応し、30分で1440枚もの画像を取得。
簡便な組織マイクロアレイ（TMA）の取得と解析
組織レベルで起こる病気のメカニズムを病理学的に調べることは、病気の状態に関する豊富な知識を提供する。しかし、病理組織や正常組織の画像を取得し、分析することは煩雑なプロセスである。
組織マイクロアレイは、この時間のかかるプロセスを回避するために開発された。TMAスライドは、複数の患者から採取した組織切片を精密に整理したもので、病的状態と年齢をマッチさせた正常対照との比較が容易にできる。TMAスライドは、H&Eなどの組織学的染色と組み合わせて、癌組織の同定に極めて有用である。本セクションでは、Biolabs社から入手したH&E染色TMAスライドの取得と解析について述べる。
肺組織切片（合計30枚：がん性15枚と年齢をマッチさせた対照15枚）をTMAフォーマットで提供し、DNA/RNAとタンパク質をそれぞれ可視化するためにヘマトキシリンとエオジンで染色した。TMAスライドは透過光と4X Plan Apo対物レンズで約2.5分でスキャンされ（図2、上）、スライド上の組織切片の位置を素早く特定することができた。次に、30個の各組織切片の周囲に領域を引き、高倍率で再撮影する領域を定義した。組織切片は20X ELWD対物レンズを使用して撮影し、サンプルごとに4x4の画像グリッドを収集した。透過光でサンプルを照射し、標準的なRGB（赤、緑、青）フィルターキューブを通して集光することにより、カラー画像を作成した。
図2 （A）透過光とRGBフィルターを用いたH&E染色肺組織のプレビュースキャン。(B-D)選択された領域をより高解像度で示す。(B）20X ELWD対物レンズで撮影した4x4グリッドの画像をつなぎ合わせた単一組織画像。(D）ヘマトキシリン陽性細胞を青色、エオシン陽性細胞を黄色で示した高解像度画像。解析はMetaXpress®カスタムモジュールエディターソフトウェアで行った。(E）癌組織と正常肺組織の配置を示すTMAスライドのレイアウト。(F）各組織切片における青色（ヘマトキシリン）陽性細胞の割合を示すMetaXpressのヒートマップ。ImageXpressシステムとMetaXpress®ソフトウェアによるスライド領域取得は、癌組織標本と正常肺組織標本の正確な識別を可能にする。
蛍光標識組織の評価
スライドスキャンは従来比色分析で行われてきたが、特異性、コントラスト、多様性、使いやすさが向上したため、多くの研究者が蛍光マーカーに移行している。また、より生物学的に関連性の高い疾患モデルを求める研究者は、組織全体の画像化に目を向けている。ここでは、ImageXpressシステムの柔軟性により、ラット脳組織のスライスにおけるアストロサイトの蛍光イメージングがどのように可能になったかを説明する。
ラット脳スライスで神経細胞の種類を識別する
ここでは、ラットから得られた脳組織の切片の画像取得を強調する。組織サンプル全体をDAPI、Alexa 488抗GFAP、Alexa 532抗F-アクチンで標識した。
ラットの脳スライドは透過光と4X Plan Apo対物レンズで約2.5分でスキャンされ（図3、上）、組織の位置をすばやく特定することができた。20倍のELWD対物レンズでカバーするスキャン領域を定義するために、組織切片の周囲に1つの領域を描いた。蛍光波長は、標準的なDAPI、FITC、TRITCフィルターキューブを用いて収集した（図3）。
図3. (A) ラット脳切片の低解像度モンタージュにより、関心領域の迅速な同定が可能。(B-F）蛍光染色したアストロサイトの高解像度画像（C, E）をMetaXpress®ソフトウェアの神経突起伸長アプリケーションモジュールを用いて解析した。(D,F）神経細胞体および神経突起の正確な同定は、画像に重ねた白マスクによって示されている。
マウス腎臓切片内の微細構造の同定
Molecular Probes社製の腎臓スライドを、DAPIフィルタリングと4X Plan Apo対物レンズを使って約2分半でスキャンし、組織の位置を素早く特定することができた。20倍のELWD対物レンズでカバーするスキャン領域を定義するために、組織切片の周囲に1つの領域が描かれた。腎臓組織内のさまざまな構造を同定するために、標準的なDAPI、FITC、Texas Redフィルターキューブを用いて蛍光Wavelengthを収集した（図4）。
図4. MetaXpress®ソフトウェアのSlide Region Acquisition Moduleを使用して画像化した腎臓組織の蛍光スライド。関心領域（赤い輪郭）から倍率を上げることで、組織全体と高倍率領域との間のシームレスな移行が可能になる。
概要
スライド画像取得と解析は、トランスレーショナルリサーチやハイコンテントスクリーニングの分野において、特に生物学的に関連性の高い組織サンプルを扱う研究者にとって重要なツールとなってきています。ImageXpress®ハイコンテントスクリーニングシステムとMetaXpressハイコンテント画像取得・解析ソフトウェアは、シンプルなワークフローで画像取得と解析を行うことができます。セットアップにかかる時間はわずか5分で、関心領域のスライドスキャンと高解像度画像の撮影は完全に自動化されており、わずか30分で1440枚もの画像を収集することができます。また、蛍光標識された組織と組織染色された組織の両方を画像化し、分析する柔軟性も備えています。進化し続ける未来に対応するため、このプラットフォームはハイコンテント解析システムも搭載しています。
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