Application Note 組織染色および蛍光標識組織の
自動スライドスキャン
- 低倍率で迅速にスキャンすることで、重要な関心領域を特定
- 大きな重なりのある画像を自動で結合
- 組織染色または蛍光標識された組織を撮像可能
- スライド撮像のセットアップは5分以内で完了
PDF版（英語）
はじめに
マルチウェルプレート形式によるセルベースアッセイの人気が高まる一方で、顕微鏡スライドの自動撮像に対する需要も増加しています。スライドアッセイの用途には、疾患状態や正常状態を示す組織切片の染色および撮像、アレイ形式でのセルベースアッセイの実施、プレート形式へ移行する前段階としてスライド上で開発済みアッセイの評価などが含まれます。
スライドはその性質上ばらつきがあり、マルチウェルプレート向けに設計されたハイコンテントシステムでの撮像は困難な場合があります。RNAiや抗体アレイのように予測可能な形式で作製されていない限り、通常は高解像度でスキャンすべき領域を目視で特定する必要があります。スライド全体を高倍率でスキャンすることは理想的ではありますが、時間やデータ保存容量の面で現実的ではありません。
ImageXpress® スクリーニングシステムは、組織染色または蛍光標識された組織における関心領域のスキャンと高解像度撮像を自動化し、効率的なワークフローの構築を可能にします。これらのシステムには、スライド作業に特化した使いやすいツールを備えた MetaXpress® ハイコンテント画像取得・解析ソフトウェアが含まれています。
本資料では、MetaXpress ソフトウェアに搭載された「Slide Region Acquisition」アプリケーションについてご紹介します。このアプリケーションを使用することで、スライドから重なり合う画像を自動で取得・結合でき、特に広範囲の連続領域を撮像する必要がある組織切片やその他の試料に有用です。
シンプルなワークフローで、低倍率および高倍率の撮像を迅速に実行可能
一般的なワークフローでは、まずスライド全体（または複数枚のスライド）を低倍率でスキャンし、その後、高解像度で撮像すべき領域を自動または手動で選択し、指定条件に従って撮像を行います。ImageXpress システムは、オートメーションに対応した3枚用スライドホルダーを使用することで、スライドライブラリー全体にわたって、低解像度スキャンと高スループット・高解像度スキャンの両方を自動で実行できます。
| スライド領域取得の設定 | |
|---|---|
| ステップ | 説明 |
| 1. スライドをロード | 準備したスライドをカバースリップが下になるようにスライドホルダーにセットします。ImageXpressシステムにセットします。カバースリップのないスライドも同様に画像化します。 |
| 2. スライドのプレビュー | 次へ スライドスキャン > プレビュースキャンの実行 を選択します。透過光（利用可能な場合）や核染色用のDAPIなど、短時間の露光でサンプル全体を観察できる低倍率（1倍～4倍）と単一波長を選択します。単一の焦点位置でスライド全体を撮像することで、時間を節約できます。 |
| 3. 領域の定義 | 高倍率でスキャンしたい領域の周囲に領域を描きます。次へ スライドスキャン > スキャン領域の作成 をクリックし、撮影領域を変換します。 |
| 4. スキャンパラメーターの定義 | 倍率、波長、露光時間、レーザーベースまたは画像ベースのオートフォーカスを含む高解像度画像パラメータを選択します。 |
| 5. スキャン | 設定を保存し、スキャンを開始します。 |
図1. ImageXpressシステムでスライドを取得するための簡略化されたワークフロー。
スライド領域の取得設定は5分以内で完了
| TMAスライド | ラット脳スライド | 腎臓スライド | |
|---|---|---|---|
| 染色 | 3 | 3 | 3 |
| # 波長数 | 3 | 3 | 3 |
| # 領域数 | 30 | 1 | 1 |
| # 領域あたりのサイト数 | 16 | 450 | 200 |
| 総撮影枚数 | 1440 | 1350 | 600 |
| セットアップに要した時間（低磁力域とROI） | 5分 | 3分 | 3分 |
| 撮影時間（高磁力） | 30分 | 41分 | 19分 |
| 解析時間 | 35分 |
28分 |
該当なし |
*MetaXpress PowerCore使用
表1. スライド画像取得の詳細「セットアップ時間」に記載されている時間は、実際に手を動かす必要がある作業時間のみを示しています。スライド上の関連組織を高倍率で撮像するために必要な作業時間は非常に短く、最大でも5分程度です。
高倍率での画像取得およびその後の解析はすべて完全に自動化されており、手作業は不要です。最大1440枚の画像を30分で取得可能で、発色法（カラー測定）または蛍光撮像のいずれにも柔軟に対応できます。
Tissue Microarray（TMA）のシンプルな取得と解析
疾患メカニズムの病理学的な研究は、組織レベルでの理解を深めるうえで非常に有益ですが、病理組織および正常組織の画像取得と解析は、手間のかかる作業となることがあります。
このような時間のかかるプロセスを効率化するために開発されたのが、ティッシュマイクロアレイ（TMA）です。TMAスライドは、複数の患者由来の組織切片を精密に配置したもので、病理状態と年齢を一致させた正常対照との比較を容易にします。特に、H&E（ヘマトキシリン・エオシン）などの組織染色と組み合わせることで、がん組織の同定に非常に有用です。本セクションでは、Biolabs社から提供されたH&E染色済みTMAスライドの取得および解析についてご紹介します。
肺組織切片（計30枚：がん組織15枚、年齢を一致させた正常対照15枚）はTMA形式で提供され、DNA/RNAおよびタンパク質を可視化するためにヘマトキシリンとエオシンで染色されました。TMAスライドは透過光と4倍のPlan Apo対物レンズを用いて約2.5分でスキャンされ（図2・上）、スライド上の組織切片の位置を迅速に特定することができました。次に、30枚の各組織切片の周囲に領域を指定し、高倍率で再撮像する範囲を定義しました。組織切片は20倍のELWD対物レンズを用いて撮像され、各サンプルにつき4×4の画像グリッドを取得しました。カラー画像は、透過光で試料を照射し、標準的なRGB（赤・緑・青）フィルターキューブを通して光を収集することで作成されました。
図2.(A) H&E染色された肺組織を、透過光およびRGBフィルターを用いてプレビュースキャンした画像。(B–D) 選択された領域を段階的に高解像度で表示。(B) 20倍ELWD対物レンズで撮像した4×4の画像グリッドをステッチして得られた単一組織画像。(D) 高解像度画像では、ヘマトキシリン陽性細胞が青、エオシン陽性細胞が黄色で識別されています。解析は MetaXpress Custom Module Editor ソフトウェアで実施しました。(E) TMAスライドのレイアウト。がん組織および正常肺組織の配置を示しています。(F) MetaXpressによるヒートマップ。各組織切片におけるヘマトキシリン（青）陽性細胞の割合を可視化しています。ImageXpress システムと MetaXpress ソフトウェアによるスライド領域取得により、がん組織と正常肺組織の正確な識別が可能になります。
蛍光標識組織の評価
スライドスキャンは従来、発色染色法によって行われてきましたが、近年では特異性、コントラスト、多様性、操作性の向上により、蛍光マーカーの利用が増えています。より生物学的に関連性の高い疾患モデルを求める研究者は、組織全体の撮像にも注目しています。ここでは、ImageXpress システムの柔軟性により、ラット脳組織切片におけるアストロサイトの蛍光撮像が可能であることを示します。
ラット脳切片における神経細胞種の識別
ここでは、ラット由来の脳組織切片の画像取得について紹介します。試料全体は、DAPI、Alexa 488抗GFAP、Alexa 532抗F-アクチンで標識されています。
ラット脳スライドは、透過光および4倍のPlan Apo対物レンズを用いて約2.5分でスキャンされ（図3・上）、組織の位置を迅速に特定することができました。組織切片の周囲に領域を指定し、20倍ELWD対物レンズでスキャンする範囲を定義しました。蛍光波長は、標準的なDAPI、FITC、TRITCフィルターキューブを用いて取得されました（図3）。
図3.(A) ラット脳切片の低解像度モンタージュ画像により、関心領域を迅速に特定可能。(B–F) 蛍光染色されたアストロサイトの高解像度画像（C, E）は、MetaXpress ソフトウェアの Neurite Outgrowth アプリケーションモジュールを用いて解析されました。(D, F) 神経細胞の細胞体および突起の正確な識別は、画像上に重ねられた白色マスクで示されています。
マウス腎組織切片内の微細構造の識別
Molecular Probes社提供の腎臓スライドは、DAPIフィルターおよび4倍のPlan Apo対物レンズを用いて約2.5分でスキャンされ、組織の位置を迅速に特定することができました。組織切片の周囲に領域を指定し、20倍ELWD対物レンズでスキャンする範囲を定義しました。蛍光波長は、標準的なDAPI、FITC、Texas Redフィルターキューブを用いて取得され、腎組織内のさまざまな構造を識別しました（図4）。
図4.MetaXpress ソフトウェアの Slide Region Acquisition モジュールを使用して撮像された腎組織の蛍光スライド画像。関心領域（赤枠）から段階的に倍率を上げることで、組織全体から高倍率領域へのシームレスな移行が可能です。
まとめ
スライドの取得と解析は、トランスレーショナルリサーチやハイコンテントスクリーニング分野において、特に生物学的に関連性の高い組織サンプルを扱う研究者にとって、ますます重要なツールとなっています。ImageXpress® ハイコンテントスクリーニングシステムは、MetaXpress ハイコンテント画像取得・解析ソフトウェアと組み合わせることで、シンプルなワークフローによる撮像と解析をサポートします。セットアップに必要な作業時間はわずか5分で、スライドスキャンおよび関心領域の高解像度撮像はすべて自動化されており、最大1440枚の画像を30分で取得可能です。蛍光標識組織と組織染色済み試料の両方に柔軟に対応できるため、進化し続ける研究ニーズにも対応可能です。本プラットフォームは、ハイコンテント解析システムとしてもフル機能を備えています。
PDF版（英語）