Application Note 化合物スクリーニングのための3Dトリプルネガティブ
乳がん患者由来腫瘍アッセイの自動化とハイコンテントイメージャー

はじめに

Oksana Sirenko, Angeline Lim | Molecular Devices
Evan F Cromwell, Ekaterina Nikolov | Protein Fluidics, Inc.
Margarite D Matossian, Courtney K Brock, Bridgette M. Collins-Burow, and Matthew E Burow | Tulane University

トリプルネガティブ乳癌は、転移、再発、薬剤耐性の高い、臨床的に攻撃的な腫瘍サブタイプである。現在、この疾患に対して臨床的に承認された低分子標的治療薬はなく、新たな治療標的を発見する必要性が極めて高い。患者由来の細胞をベースとした3Dガン細胞モデルは、ガン研究、薬剤開発、個別化医療にとって非常に貴重なツールである。一次腫瘍由来モデルは、腫瘍の不均一性や形態、複雑な遺伝的・分子的組成を再現することができ、それによって薬剤開発や薬剤試験が加速される。しかしながら、3Dアッセイを実施することの複雑さが、化合物スクリーニングにこの方法を採用するためのハードルとなっている。

本研究では、複雑な3D細胞ベースアッセイのスケールアップを可能にするイメージングと細胞培養法の自動化について述べる。我々は、IXM-C HT.ai共焦点イメージングシステム、自動CO2インキュベーター、自動化リキッドハンドラー（Biomek i7）、およびコラボレーティブロボットを含む統合ワークセルを開発した。ワークセルのプロトコル設定により、化合物試験、培養モニタリング、ハイコンテントイメージングによる薬剤の表現型効果の評価の自動化が可能となった。腫瘍細胞は、トリプルネガティブ乳がんのサブタイプである準形成乳がんを示す患者由来の腫瘍摘出物、TU-BcX-4ICから単離された初代細胞から形成された。化合物とのインキュベーション中、腫瘍細胞は透過光イメージングを用いて毎日モニターされ、機械学習ベースの画像解析により腫瘍細胞の大きさ、直径、完全性、光学密度の特徴が明らかにされた。エンドポイントアッセイでは、腫瘍細胞を生存率色素で染色し、自動共焦点イメージングシステムを用いて画像化した。サイズと完全性、細胞形態と生存率の特徴づけ、および様々な細胞マーカーの存在と発現レベルの決定など、腫瘍の表現型と化合物効果の研究に使用できる複数の定量的記述子の特徴を明らかにした。

3Dがんアッセイと化合物スクリーニングのスループット向上と自動化のための方法を説明し、ツールを実証する。さらに、複雑な細胞システム、疾患表現型、化合物の効果について、科学者がより多くの情報を得ることを可能にする高度な解析アプローチと記述子を示します。

方法

セル培養

腫瘍細胞およびPDXオルガノイド(PDXO)の作製法については、すでに記述されている(Matossian, et al 2021)。原発腫瘍サンプルはSCID/Beigeマウスに移植され、最大腫瘍体積>1000 mm3に達するまで14日間と急速な腫瘍増殖を示したので、そのサンプルから2D培養で増殖可能な細胞株を作製した。2Dで増殖した4IC細胞から腫瘍が形成された。4IC細胞を1ウェルあたり2,000個ずつ分注し（U-shape low attachment 384 plate, コーニング社製）、48時間培養してタイトな腫瘍体を形成させた。4IC細胞は、グルコース、NEAA、2mMグルタミン、インスリン120μg/L、10％FBSを添加したAdvanced DMEMで培養した（Gibco 12491-015）。代謝アッセイのために、腫瘍細胞はDMEM＋10％透析血清（2mMグルタミン、5mMグルコース、フェノールレッドなし）で培養した。

細胞のモニタリングとイメージング

ImageXpress® Confocal HT.ai ハイコンテントイメージングシステム（Molecular Devices）で、MetaXpressハイコンテント画像解析ソフトウェアを用いて透過光（TL）蛍光画像を取得した。腫瘍像はTLで約60μmのオフセットで取得した。Z-スタック画像は10Xまたは20X対物レンズを用い、共焦点モードで取得した。解析にはMetaXpressまたはIN Carta™画像解析ソフトウェアを使用した。

細胞培養とイメージングプロトコルの自動化

オルガノイドのイメージングと解析を自動化することは、オルガノイドにおける表現型の変化を定量的に評価し、実験や試験のスループットを向上させるために重要である。我々は、オルガノイドと幹細胞の成長と分化の自動モニタリング、維持、特性評価、および様々な化合物の効果試験を可能にする自動化された統合システムを構築した。自動化システムには、ImageXpress Confocal HT.aiシステムと解析ソフトウェア、自動CO2インキュベーター、Biomek i7自動化リキッドハンドラー、協働ロボットとレールが含まれる。ロボットの自動化はGreen Button Goソリューションによって実現された。

研究成果

3D腫瘍体の培養と画像化

3次元腫瘍様細胞培養は、原発性トリプルネガティブ腫瘍から開始した（Methodsのセクションを参照）。細胞株は、プライマリー組織をSCIDマウスで継代培養することにより開発し、2D細胞培養に採用した。384ウェル低密着プレートで2,000個の細胞を48時間プレーティングして腫瘍様細胞を形成し、その後、NCI（米国国立がん研究所）の承認抗がん剤ライブラリーの化合物で腫瘍様細胞を処理した。試験には5種類の濃度を用いた

細胞培養、化合物処理、イメージングの自動化

化合物の希釈、セル処理、染色にはBiomekオートメーションが使用された。その後、腫瘍細胞は培養され、自動イメージングによって毎日モニターされた。腫瘍の表現型、密度、大きさはAIベースの画像解析によって自動的に検出され、特徴づけられた。エンドポイントアッセイのために、細胞はヘキスト、カルセインAM、EtHDの組み合わせで染色され、複雑な表現型解析のためにカスタムモジュールエディターを用いて解析された。

形質転換トリプルネガティブ乳がん腫瘍体を標的としたNCIライブラリーからの化合物の同定

3D腫瘍培養は、疾患モデリングと化合物効果の評価に非常に有用なツールです。自動ワークフローは、化合物スクリーニングのためのアッセイのスケールアップを可能にし、アッセイの再現性と使いやすさを向上させる。腫瘍細胞のイメージングと解析の自動化は、腫瘍細胞の表現型の変化を定量的に評価し、複雑な生物学的反応をモニターするために重要である。イメージングからは、腫瘍の大きさ、完全性（面積）、さまざまなマーカーの強度、細胞数、特徴など、複数の読み出しが可能である。

我々は、NCIライブラリーの168化合物の効果を、10倍希釈の5つの濃度でテストした： 10nM、100nM、1000nM（1μM）、10μM、100μMである。次に、腫瘍の完全性（腫瘍面積）と生存率（生存細胞率）を評価し、異なる濃度でヒットを同定した。その結果、従来のがん治療に抵抗性を示す腫瘍サブタイプを標的とする有効性を示す薬剤がいくつか同定された。以下に示す薬剤は、示された濃度で腫瘍様表現型に有効性を示した（高濃度には低濃度のものも含まれる）。

表示濃度で有効な化合物のリスト：

選択した化合物の用量反応と二次特性評価

化合物のサブセットは、二次追跡分析のために選択された。化合物は1-10000 nMの範囲で7つの濃度で試験された。EC50値は腫瘍崩壊測定を使用して決定した。

結論

• 我々は、原発性トリプルネガティブメタプラスティック癌細胞サンプル由来の3D腫瘍細胞を用いた化合物スクリーニングアッセイを実証した。NCIライブラリーの168化合物を数濃度にわたって試験し、3D細胞アッセイで有効性を示す化合物をいくつか同定した。
• 自動イメージングシステム、自動リキッドハンドラー、自動インキュベーター、および協調ロボットを統合することにより、腫瘍様細胞アッセイと化合物処理のプロセスを自動化した。これらのインストゥルメンテーションにより、がんバイオロジーにおける化合物スクリーニングに使用可能な3D細胞モデルの細胞培養、維持、化合物処理が自動化された。
• 3D解析と組み合わせた共焦点イメージングにより、オルガノイドの細胞含有量の複雑で定量的な解析が可能になり、異なる表現型を持つ細胞のカウントや測定も可能になった。この方法は、抗がん化合物の効果試験や疾患モデリングに利用できる。