Application Note CRISPRによる細胞株開発ワークフロー自動化
ライフサイエンス研究の効率化

Prathyushakrishna Macha, PhD｜研究員｜モレキュラーデバイス

はじめに

製薬分野における高速なハイスループット細胞株開発と、より優れたスクリーニングに対する需要の増加により、研究施設や企業は既存のラボを自動化する方向に進んでいます。ロボティクスは約40年前から一部のラボで導入されていましたが、現在ではより一般的になり、ウォークアウェイタイムを増加させることで、研究者を反復作業から解放する役割を果たしています。サンプルハンドリング、遠心、ラックへの移動、液体ハンドリングといったスキルを必要としない工程の負担を軽減するため、シンプルなアッセイから複雑なアッセイまで自動化が可能です。ロボティクスの新しいトレンドにより、より優れた、小型でプログラムが容易なロボットが登場し、統合されたワークセルソリューションに簡単に組み込むことができます *1,*2。

一般的な細胞株開発では、安定した細胞を見つけるために数万のクローンをスクリーニングする必要があります。ここでは、哺乳類細胞株開発ワークフローの自動化について説明します。具体的には、トランスフェクトされた細胞の編集、モノクロナリティ、増殖評価を統合的に自動スクリーニングするシステムです（図1）。このシステムには複数の装置と協働ロボットが含まれ、シングルセルの分注からモノクローナル細胞のスクリーニング、さらに検証アッセイのための拡大まで、すべての工程を実行します。この統合システムは、スループットを低レベルから高レベルへと向上させるだけでなく、一貫性を高めることでヒューマンエラーを排除します。細胞は可能な限り最適な条件で維持され、週末もモニタリングされるため、生産期間が大幅に短縮され、スケーラビリティが加速します。この自動化ワークセルソリューションには図1に示すすべての装置が含まれています。さらに、アッセイの要件や複雑さに応じて、他の装置を容易に追加できます *3,*6。

ケーススタディ

CRISPR編集細胞株のモノクロナリティスクリーニングの自動化

統合システムには、シングルセルプリンター、Clone Select Imager – Florescence（CSI-FL）、リキッドハンドラー、自動インキュベーター、ホテル、バーコードリーダー、協働ロボットが含まれています。このシステムを使用して、トランスフェクトされた細胞を96ウェルおよび384ウェルプレートにプリントし、Day 0でモノクロナリティを評価し、増殖を定期的にモニタリングしました。これらのツールを用いた複雑なワークフローにより、スループットと遺伝子編集アッセイの自動化が向上し、細胞のモノクロナリティをスクリーニングし、エンドポイントアッセイを実施しました。このソリューションは細胞だけでなく、さまざまな用途に向けたCRISPR編集オルガノイドの開発にも適用できます（図1）。

装置の操作は、自動ラボスケジューリングソフトウェア（GBG、図2）を使用してワークフローの工程を事前にスケジュールしました。細胞のCRISPR編集と維持は、リキッドハンドラーとインキュベーターを用いて実施しました。その後、これらの細胞をマルチウェルプレートにシングルセル分注し、モノクローナル細胞株を開発しました。これらのマルチウェルプレートはDay 0にイメージングされ、その後Day 14までCSI-FLを用いてイメージングを行い（図3および図4）、Day 0モノクロナリティ保証レポート（図1）を生成し、各細胞の増殖をモニタリングしました。細胞は電子的に追跡され、モニタリングパラメータはプレートデータに保存されました：細胞コンフルエンス、細胞数推定、増殖曲線。装置は細胞増殖を客観的かつ定量的に評価し、接着性または沈降懸濁細胞タイプに対応します。これにはCHO、HEK、ハイブリドーマ、iPSCなど多様な細胞タイプが含まれます。ここでは、p53 KO用のCRISPRプラスミド（Santa Cruz Bio）を使用し、トランスフェクションによって接着性モノクローナルHEK-293細胞株を開発しました。この細胞株はさらに編集検証のためのエンドポイントアッセイに供されました［引用アプリケーションノート：7–9］。

まとめ

自動化装置とCSI-FLを用いることで、編集された細胞はモノクロナリティを容易にイメージングおよび追跡でき、数週間のウォークアウェイタイムが確保されます。スループット、信頼性、コンタミネーションのリスクは劇的に改善されました。高品質なCRISPR編集細胞株が得られ、エンドポイントアッセイに使用されました。細胞株開発のタイムライン短縮と自動化ソリューションに対する需要の増加に応えるため、CSI-FLを組み込んだ自動統合システムワークフローを提供します。

参考文献

1. Lindgren, Kristina, et al. “Automation of cell line development.” Cytotechnology 59.1 (2009): 1-10
2. F. Mirasol, “The Role of Automation in Cell-Line Development,” BioPharm International 32 (1) 2019.
3. Felder, RA, Boyd, JC, Savory, J, Margrey, K, Martinez, A, Vaughn, D. Robotics in the clinical laboratory. Rev Clin Lab Med 1988; 8:699–711. https://doi.org/10.1016/s0272-2712(18)30657-7.Search in Google Scholar
4. Wheeler, MJ. Overview on robotics in the laboratory. Ann Clin Biochem 2007; 44:209–18. https://doi.org/10.1258/000456307780480873.Search in Google Scholar
5. Lippi, G, Da Rin, G. Advantages, and limitations of total laboratory automation: a personal overview. Clin Chem Lab Med 2019; 57:802–11. https://doi.org/10.1515/cclm-2018-1323.Search in Google Scholar
6. Chapman, T. Lab automation and robotics: Automation on the move. Nature 421, 661–663 (2003). https://doi.org/10.1038/421661a
7. Accelerating gene edited cell lines with the CloneSelect Imager FL, Molecular Devices.
8. CloneSelect Imager FL fluorescent imaging for rapid day zero monoclonality assurance, Molecular Devices.
9. What is Gene Editing, CRISPR Engineering, CRISPR/Cas9 | Molecular Devices

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