Application Note THUNDER TR-FRETアッセイを用いた
細胞ベースのERK1/2リン酸化測定

シンプルで迅速なアッセイワークフローを備えた、非常にロバストなホモジニアスアッセイ
細胞を血清飢餓状態にすることなく、明確で完全な濃度反応曲線を生成する高感度アッセイ
EC₅₀とIC₅₀の値は公表データと一致
学術および創薬アプリケーションの両方に適しています

PDF版（英語）

はじめに

Joyce Itatani | Applications Scientist | モレキュラーデバイス
Cathy Olsen, PhD | Sr. Applications Scientist | モレキュラーデバイス

MAPK/ERK細胞シグナリング経路は、細胞表面に位置する受容体チロシンキナーゼの活性化から始まり、一連のキナーゼリン酸化ステップ（キナーゼカスケード）を経て、遺伝子発現の変化をもたらす転写因子の活性化へと至ります。ERK1/2とも呼ばれるERK1とERK2は、この経路の一部としてリン酸化され、細胞増殖と分化に関与する転写因子を含む他のオンターゲットをリン酸化し活性化します。この経路の破壊や調節異常は、様々ながんの発症につながる可能性があります *1。

THUNDER™は、Bioauxilium Research社が開発した、汎用性が高く費用対効果の高い細胞ベースアッセイプラットフォームであり、学術研究と創薬研究の両方に適合する方法で、リン酸化された個々の内因性タンパク質と総内因性タンパク質を測定することができます。THUNDER™ Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)アッセイキットは、均一性時間分解フェルスター共鳴エネルギー移動（TR-FRET）サンドイッチイムノアッセイであり、3つのステップからなるシンプルなワークフローを採用しています（図1）。細胞処理後、細胞を溶解し、溶解液中のPhospho-ERK1/2 (T202/Y204) を一対の蛍光標識抗体を用いて、洗浄ステップのないシングルステップの試薬添加で検出します。第一抗体Eu-Ab1は、ドナー蛍光体として機能するユーロピウムキレートで標識されています。第二の抗体 FR-Ab2 は遠赤アクセプター蛍光体で標識されています。

***図1．
THUNDER TR-FRETのワークフローは3ステップで構成され、洗浄は行いません。2プレート（トランスファー）法を示します。

標的ERK1/2タンパク質上の異なるエピトープにこれら2つの標識抗体を結合させると、ドナーとアクセプター蛍光体が近接し、ドナーのユーロピウムキレートの励起がアクセプター蛍光体へのFRETを引き起こし、665 nmにTR-FRETシグナルが生じます（図2）。ユーロピウムキレートからの残留エネルギーが615 nmの光を発生します。665 nmのシグナルは細胞溶解液中のPhospho-ERK1/2 (T202/ Y204)の量に比例し、データは665 nmのシグナルまたは665 nm/615 nm比のいずれかで表されます。

***図2.*.
THUNDER TR-FRETサンドイッチイムノアッセイ。Eu-Ab1とFR-Ab2の両方が分析物に結合することで、ユーロピウムキレートからアクセプター蛍光体へのエネルギー移動が可能となり、時間分解検出モードのマイクロプレートリーダーを用いて検出される665nmのシグナルが得られます。

ここでは、費用対効果の高いTHUNDER Phospho-ERK1/2（T202/Y204）アッセイを用いて、HEK293細胞におけるEGF誘導性のERK1/2リン酸化を測定できることを示します。また、非小細胞肺がんや膵臓がん2 の治療に用いられる薬剤であるエルロチニブ（タルセバ®）によるこのリン酸化の阻害を評価する方法も示します。SpectraMax® iD5、i3x、およびM5eマルチモードマイクロプレートリーダーとSoftMax® Proソフトウェアを使用すると、合理的なデータ解析とグラフ化により、堅牢なアッセイデータが生成されます。

材料

THUNDER Phospho-ERK1/2 (T202/Y204) TR-FRET 細胞シグナリングアッセイキット (Bioauxilium)
96ウェルクリア、ポリ-L-リジンコートマイクロプレート (Corning)
白色96ウェルハーフエリアマイクロプレート (Corning)
HEK293 細胞株 (ATCC)
増殖培地フェノールレッド（Corning）+10%ウシ胎児血清（FBS, Avantor Seradigm）+1%ペニシリン/ストレプトマイシン（Thermo Fisher ）を封入したMEM（Minimum Essential Medium）。
リコンビナントヒトEGF（R&Dシステムズ社）
エルロチニブ塩酸塩（Sigma）
水、分子生物学グレード（Growcells）
SpectraMax iD5 マルチモードマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス：
⚪︎改良TRFモジュール
⚪︎フィルターリング 320 nm BW 100 nm、616 nm BW 10 nm、665 nm BW 10 nm
SpectraMax i3xマルチモードマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス　#i3x）
⚪︎TR-FRET検出カートリッジ（HTRF®、モレキュラーデバイス P/N 0200-7011）
pectraMax M5eマルチモードマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス　#M5e）

方法

細胞調製

増殖培地（MEM/10% FBS/1% penicillin/streptomycin）中のHEK293細胞を、96ウェルポリ-L-リジンコートマイクロプレートに50,000細胞/ウェル、50μL/ウェルで播種しました。細胞は37℃、5% CO2で一晩接着させ、増殖させた。血清飢餓は必要なかったです。

試薬の調製

5X Lysis Buffer 1を超純水で1Xに希釈し、最終濃度1Xに希釈した100X Phosphatase Inhibitor Cocktailを加えることにより、1X Supplemented Lysis Bufferを調製しました。補足1X溶解バッファー1は、1mMフッ化ナトリウム、2mMオルトバナジン酸ナトリウム、2mMβ-グリセロリン酸塩を封じ込めました。
1X Detection Buffer は、10X Detection Buffer を超純水で希釈して作製しました。
4X Antibody Detection Mix in 1X Detection Buffer は、ユーザーマニュアルの指示に従い作製しました。100 点キットの場合、255 μL の 1X Detection Buffer を 5 μL の Eu-Ab1 原液の入ったバイアルに加えました。20μLのFR-Ab2ストック溶液の入ったバイアルに240μLの1X Detection Bufferを加えました。260μLの希釈済みEu-Ab1と260μLの希釈済みFR-Ab2を合わせ、穏やかに混合しました。

EGF刺激

10 nMから0.003 nMまでのEGFの2X作業溶液50 μLを、二重ウェル中の細胞に添加し、細胞を室温で10分間インキュベートしました。その後、細胞層を乱さないように培地を静かに吸引しました。50μLの1X補足溶解バッファーをウェルに加え、環状シェーカーで30分間室温でインキュベートしました。

インキュベーション後、各ウェルの細胞溶解液15μLを白色96ウェルハーフエリアマイクロプレートに移しました。4X Antibody Detection Mix 5μLを各ウェルに加え、プレートをプレートシールで覆い、室温で4時間インキュベートしました。その後、プレートを SpectraMax iD5、 SpectraMax i3x、 SpectraMax M5e プレートリーダーで表1の設定を用いて読み取りました。

Parameter	iD5設定	i3x設定	M5e設定
Optical configuration	(N/A)	Cartridge – HTRF	(N/A)
Read mode	TR-FRET (Enhanced TRF Module and filters must be installed)	TR-FRET	TRF
Read type	Endpoint	Endpoint	Endpoint
Wavelengths	Use Filters Excitation: 320 nm* Emission 1: 616 nm Emission 2: 665 nm	Excitation: 340 nm Emission 1: 616 nm Emission 2: 665 nm	Excitation: 314 nm Emission 1: 616 (Cutoff 570 nm) Emission 2: 665 (Cutoff 630 nm)
Plate type	96 well Corning half area	96 well Corning half area	96 well Corning half area
PMT and Optics	Flashes per read: 100 Excitation time: 0.05 ms Measurement delay: 0.05 ms Integration time: 0.3 ms Read height: 9.31 mm	Pulses: 100 Excitation time: 0.05 ms Measurement delay: 0.05 ms Integration time: 0.3 ms Read height: 6.28 mm	Flashes per read: 100 Measurement delay: 0.1 ms Integration time: 0.3 ms
More settings	Show Pre-Read Optimization options	Show Pre-Read Optimization options

*320 nm Exフィルターを使用すると、SpectraMax iD5プレートリーダーで最適な結果が得られますが、標準的な340 nmフィルターを使用することもできます。

表 1. SpectraMax iD5、i3x、M5eプレートリーダーの推奨設定。SpectraMax iD5およびi3xプレートリーダーの場合、マイクロプレートおよびリードハイトは、使用するマイクロプレートの新しいロットまたはアッセイ量ごとに最適化する必要があります（SoftMax Proソフトウェアの装置設定でShow Pre-Read Optimizationオプションを使用）。

エルロチニブ阻害

25μLのエルロチニブ4倍希釈液を細胞に添加し、最終濃度を1:3連続希釈で10μM～0.001μMとしました。プレートを室温で15分間インキュベートしました。その後、細胞をEC₈₀が0.7 nMのEGFで刺激し、上記のEGF刺激アッセイで説明したように決定しました。EC₈₀（2.8nM）のEGFの4倍作用溶液25μLをウェルに加え、プレートを室温で10分間インキュベートしました。培地を注意深く除去し、50μLの1X補充溶解バッファーを各ウェルに加えました。その後、プレートを室温で30分間、環状シェーカーでインキュベートしました。

インキュベーション後、各ウェルの細胞溶解液15μLを白色96ウェルハーフエリアマイクロプレートに移しました。4X Antibody Detection Mix 5μLを各ウェルに加え、プレートをプレートシーラーで覆い、室温で4時間インキュベートしました。その後、プレートをSpectraMax iD5、SpectraMax i3x、SpectraMax M5eプレートリーダーで表1の設定を用いて読み取りました。

データ解析

TR-FRET比は、665nmのRFU値を616nmのRFU値で割って算出し、得られた数値に1000を乗じました。バックグラウンドサブトラクションは必要なかったです。TRFRET比を、SoftMax Proソフトウェアの4-parameter logistic curve fitを用いて、EGF濃度（刺激アッセイ用）またはエルロチニブ濃度（阻害アッセイ用）に対してプロットしました。得られた曲線から、EC₅₀ 値と IC₅₀値がソフトウェアによって自動的に算出されました。

結果

HEK293細胞のEGF刺激により、ERK1/2（T202/Y204）リン酸化が増加し、その濃度応答はシグモイド曲線に従いました。TR-FRET比を4-parameter logistic curve fitを用いてEGF濃度に対してプロットし、そこからSpectraMaxプレートリーダーで得られたデータについて0.28 nMから0.41 nMのEC₅₀値を算出しました（図3）。これらの値は、公表されているTHUNDER TR-FRETアッセイのEC₅₀値と一致していました *3。

***図3．
EGFによって誘導される濃度依存的なERK1/2（T202/Y204）リン酸化。SpectraMax iD5（赤）、i3x（緑）、M5e（青）プレートリーダーで得られた結果を4-parameter logisticを使ってプロットし、SoftMax Proソフトウェアを用いて0.28 nM～0.41 nMのEC₅₀値を算出しました。

注：THUNDERアッセイでは、SpectraMax M5eプレートリーダーの性能はSpectraMax M5プレートリーダーの性能と同等です。

エルロチニブによるリン酸化阻害の測定能力は、細胞を濃度を増加させたエルロチニブでインキュベートした後、最初の刺激アッセイから決定されたEC₈₀濃度である0.7 nM EGFで細胞を刺激することによりテストされました。各SpectraMaxプレートリーダーについて、SoftMax Proソフトウェアで得られた4-parameter curve fits処理から、42 nMから63 nMのIC₅₀値が算出されました（図4）。ここでも、以前に発表された値3 と一致しました。

***図4.*.

エルロチニブによるEGF誘発ERK1/2リン酸化（T202/Y204）の阻害。SpectraMax iD5（赤）、i3x（緑）、M5e（青）プレートリーダーで得られたデータを SoftMax® Proソフトウェアの4-parameter logisticを使ってプロットし、曲線から42～63 nMのIC₅₀値を算出しました。

	EC₅₀ (EGF)	Assay S/B（EGF）	IC₅₀ (Erlotinib）	Assay S/B（EGF）
SpectraMax iD5 プレートリーダー	0.35 nM	3.4	56 nM	3.7
SpectraMax i3x プレートリーダー	0.41 nM	3.7	63 nM	3.8
SpectraMax M5e プレートリーダー	0.28 nM	4.5	42 nM	3.8

EC₅₀

(EGF)

Assay S/B（EGF）

IC₅₀

(Erlotinib）

Assay S/B（EGF）

SpectraMax iD5
プレートリーダー

0.35 nM

3.4

56 nM

3.7

SpectraMax i3x
プレートリーダー

0.41 nM

3.7

63 nM

3.8

SpectraMax M5e
プレートリーダー

0.28 nM

4.5

42 nM

3.8

表 2. THUNDER Phospho-ERK1/2 (T202/Y204) TR-FRET アッセイに関するデータの要約。EGF誘導性リン酸化およびエルロチニブによるリン酸化阻害について、各プレートリーダーで得られたEC₅₀、IC₅₀、およびアッセイのSB比を示します。

結論

全体として、THUNDER Phospho-ERK1/2（T202/Y204）アッセイは、SpectraMax iD5、i3x、M5eプレートリーダーで、頑健なTR-FRETシグナル、広いダイナミックレンジ、高いS/B比、期待される薬理作用を示しました。今回のデータは、モレキュラーデバイスのプレートリーダーにおけるTHUNDER細胞シグナリングアッセイプラットフォームを検証するものです。

参考文献

Braicu C, Buse M, Busuioc C, Drula R, Gulei D, Raduly L, Rusu A, Irimie A, Atanasov AG, Slaby O, Ionescu C, and Berindan- Neagoe I. A comprehensive review on MAPK: A promising therapeutic target in cancer. Cancers, 11(10) (2019), p 1618.
Bareschino MA, Schettino C, Troiani T, Martinelli E, Morgillo F, and Ciardiello F. Erlotinib in cancer treatment. Annals of Oncology, 18:6 (2007), pp.
THUNDER ™ Phospho-ERK1/2 (T202/Y204) TR-FRET Cell Signaling Assay Kit Technical Data Sheet: https://bioauxilium.com/. com/product/phospho-erk1-2-t202-y204/

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