Application Note ERK1/2リン酸化解析に最適な
THUNDER TR-FRETセルベースアッセイ

はじめに

Joyce Itatani | Applications Scientist | モレキュラーデバイス
Cathy Olsen, PhD | Sr. Applications Scientist | モレキュラーデバイス

MAPK/ERK細胞シグナル伝達経路は、細胞表面に存在する受容体型チロシンキナーゼの活性化から始まり、一連のキナーゼリン酸化ステップ（キナーゼカスケード）を経て、遺伝子発現の変化を引き起こす転写因子の活性化に至ります。ERK1およびERK2（ERK1/2とも呼ばれます）は、この経路の一部としてリン酸化され、その後、細胞増殖や分化に関与する転写因子を含む他の標的をリン酸化し、活性化します。この経路の破綻や調節異常は、さまざまな種類のがんの発症につながる可能性があります *1。

THUNDER™は、Bioauxilium Research社が開発した、学術研究と創薬研究の両方に対応可能な、個々のリン酸化タンパク質および総内因性タンパク質を測定するための汎用性とコスト効率に優れたセルベースアッセイプラットフォームです。THUNDER™ Phospho-ERK1/2（T202/Y204）アッセイキットは、3ステップのシンプルなワークフローで構成される均一型の時間分解型FRET（TR-FRET）サンドイッチイムノアッセイです（図1）。細胞処理後、細胞を溶解し、溶解液中のPhospho-ERK1/2（T202/Y204）を、蛍光色素標識抗体のペアを用いた単一ステップの試薬添加で検出します。洗浄ステップは不要です。最初の抗体Eu-Ab1は、ドナー蛍光体として機能するユウロピウムキレートで標識されています。2番目の抗体FR-Ab2は、Far-red蛍光アクセプターで標識されています。

これら2種類の標識抗体が標的ERK1/2タンパク質上の異なるエピトープに結合することで、ドナーとアクセプター蛍光体が近接し、ドナーであるユウロピウムキレートの励起によりアクセプター蛍光体へのFRETが誘発され、665 nmでTR-FRETシグナルが発生します（図2）。ユウロピウムキレートからの残留エネルギーは615 nmで光を発します。665 nmのシグナルは細胞溶解液中のPhospho-ERK1/2（T202/Y204）の量に比例し、データは665 nmのシグナルまたは665 nm/615 nm比として表すことができます。

ここでは、コスト効率に優れたTHUNDER Phospho-ERK1/2（T202/Y204）アッセイを用いて、HEK293細胞におけるEGF誘導性ERK1/2リン酸化を測定する方法を示します。また、非小細胞肺がんや膵がんの治療に使用される薬剤Erlotinib（Tarceva®）によるこのリン酸化の阻害評価についても紹介します *2。SpectraMax® iD5、i3x、M5eマルチモードマイクロプレートリーダーとSoftMax® Proソフトウェアを使用することで、堅牢なアッセイデータを取得し、データ解析とグラフ作成を効率化できます。

材料

• THUNDER Phospho-ERK1/2 (T202/Y204) TR-FRET 細胞シグナリングアッセイキット (Bioauxilium)
• 96ウェルクリア、ポリ-L-リジンコートマイクロプレート (Corning)
• 白色96ウェルハーフエリアマイクロプレート (Corning)
• HEK293 細胞株 (ATCC)
• 増殖培地 フェノールレッド（Corning）+10%ウシ胎児血清（FBS, Avantor Seradigm）+1%ペニシリン/ストレプトマイシン（Thermo Fisher ）を封入したMEM（Minimum Essential Medium）。
• リコンビナントヒトEGF（R&Dシステムズ社）
• エルロチニブ塩酸塩（Sigma）
• 水、分子生物学グレード（Growcells）
• SpectraMax iD5 マルチモードマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス：
  ⚪︎改良TRFモジュール
  ⚪︎フィルターリング 320 nm BW 100 nm、616 nm BW 10 nm、665 nm BW 10 nm
• SpectraMax i3xマルチモードマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス　#i3x）
  ⚪︎TR-FRET検出カートリッジ（HTRF®、モレキュラーデバイス P/N 0200-7011）
• pectraMax M5eマルチモードマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス　#M5e）

方法

細胞調製

HEK293細胞を増殖培地（MEM/10% FBS/1%ペニシリン/ストレプトマイシン）中で、ポリ-L-リジンコート済み96ウェルマイクロプレートに1ウェルあたり50,000細胞、50 μLで播種しました。細胞は37°C、5% CO₂で一晩付着・増殖させました。血清飢餓は不要です。

試薬の調製

• 1X補足溶解バッファーは、5X溶解バッファーを超純水で1Xに希釈し、100Xホスファターゼ阻害剤カクテルを最終濃度1Xになるように添加して作製しました。補足1X溶解バッファーには、1 mMフッ化ナトリウム、2 mMメタバナジン酸ナトリウム、2 mMβ-グリセロリン酸が含まれます。
• 1X検出バッファーは、10X検出バッファーを超純水で希釈して作製しました。
• 4X抗体検出ミックスは、ユーザーマニュアルの指示に従って1X検出バッファー中で調製しました。100ポイントキットの場合、Eu-Ab1ストック溶液5 μLを含むバイアルに1X検出バッファー255 μLを添加しました。FR-Ab2ストック溶液20 μLを含むバイアルに1X検出バッファー240 μLを添加しました。希釈済みEu-Ab1 260 μLと希釈済みFR-Ab2 260 μLを混合し、穏やかに撹拌しました。

EGF刺激

EGFの2Xワーキング溶液（10 nM～0.003 nM）50 μLを細胞に添加し、二重測定で室温で10分間インキュベートしました。その後、細胞層を乱さないように培地を穏やかに吸引しました。1X補足溶解バッファー50 μLをウェルに添加し、プレートを室温でオービタルシェーカー上で30分間インキュベートしました。

インキュベーション後、各ウェルから細胞溶解液15 μLを96ウェルハーフエリア白色マイクロプレートに移し、4X抗体検出ミックス5 μLを各ウェルに添加しました。プレートをシールで覆い、室温で4時間インキュベートしました。その後、プレートをSpectraMax iD5、SpectraMax i3x、SpectraMax M5eプレートリーダーで読み取り、設定は表1に示すとおりです。

* SpectraMax iD5プレートリーダーでは320 nm励起フィルターを使用すると最適な結果が得られますが、標準的な340 nmフィルターも使用できます。

表1. SpectraMax iD5、i3x、M5eプレートリーダーの推奨設定。SpectraMax iD5およびi3xプレートリーダーでは、マイクロプレートおよび読み取り高さは、マイクロプレートの新しいロットや使用するアッセイ容量ごとに最適化する必要があります（SoftMax Proソフトウェアの機器設定で「Show Pre-Read Optimization」オプションを使用してください）。

Erlotinib阻害

Erlotinibの4Xワーキング希釈液25 μLを細胞に添加し、最終濃度が10 μMから0.001 μMまでの1:3系列希釈になるようにしました。プレートは室温で15分間インキュベートしました。その後、EGF刺激アッセイで決定したEC₈₀（0.7 nM）で細胞を刺激しました。EC₈₀のEGF（2.8 nM）の4Xワーキング溶液25 μLをウェルに添加し、プレートを室温で10分間インキュベートしました。培地を慎重に除去し、各ウェルに1X補足溶解バッファー50 μLを添加しました。プレートは室温でオービタルシェーカー上で30分間インキュベートしました。

インキュベーション後、各ウェルから細胞溶解液15 μLを96ウェルハーフエリア白色マイクロプレートに移し、4X抗体検出ミックス5 μLを各ウェルに添加しました。プレートをシールで覆い、室温で4時間インキュベートしました。その後、プレートをSpectraMax iD5、SpectraMax i3x、SpectraMax M5eプレートリーダーで読み取り、設定は表1に示すとおりです。

データ解析

TR-FRET比は、665 nmの読み取りRFU値を616 nmの読み取りRFU値で割り、その結果に1000を掛けて算出しました。バックグラウンドの差し引きは不要でした。TR-FRET比は、EGF刺激アッセイの場合はEGF濃度、阻害アッセイの場合はErlotinib濃度に対してプロットし、SoftMax Proソフトウェアで4パラメータロジスティック方程式を使用しました。得られた曲線から、EC₅₀およびIC₅₀値はソフトウェアによって自動的に計算されました。

結果

HEK293細胞のEGF刺激により、ERK1/2（T202/Y204）のリン酸化が増加し、濃度応答はシグモイド曲線に従いました。TR-FRET比はEGF濃度に対してプロットされ、4パラメータロジスティックカーブフィットを用いて、SpectraMaxプレートリーダーで得られたデータからEC₅₀値は0.28 nMから0.41 nMと計算されました（図3）。これらの値は、THUNDER TR-FRETアッセイに関する公開EC₅₀値と一致していました *3。

注：THUNDERアッセイでは、SpectraMax M5eプレートリーダーの性能はSpectraMax M5プレートリーダーと同等です。

Erlotinibによるリン酸化阻害の測定は、細胞をErlotinibの濃度を段階的に増加させてインキュベートし、その後、初期刺激アッセイで決定したEC₈₀濃度（0.7 nM）のEGFで刺激することで行いました。各SpectraMaxプレートリーダーで得られたデータから、SoftMax Proソフトウェアで4パラメータカーブフィットを用いてIC₅₀値は42 nMから63 nMと計算されました（図4）。これも公開値と一致していました *3。

表2. THUNDER Phospho-ERK1/2（T202/Y204）TR-FRETアッセイのデータ概要。EGF誘導性リン酸化およびErlotinibによるリン酸化阻害について、各プレートリーダーで得られたEC₅₀、IC₅₀、およびアッセイのシグナル/バックグラウンド比を示します。

結論

THUNDER Phospho-ERK1/2（T202/Y204）アッセイは、SpectraMax iD5、i3x、M5eプレートリーダーで堅牢なTR-FRETシグナル、広いダイナミックレンジ、高いS/B比、および期待される薬理学的応答を示しました。今回のデータは、モレキュラーデバイスのプレートリーダーにおけるTHUNDER細胞シグナルアッセイプラットフォームの有効性を検証するものです。

参考文献

1. Braicu C, Buse M, Busuioc C, Drula R, Gulei D, Raduly L, Rusu A, Irimie A, Atanasov AG, Slaby O, Ionescu C, and Berindan- Neagoe I. A comprehensive review on MAPK: A promising therapeutic target in cancer. Cancers, 11(10) (2019), p 1618.
2. Bareschino MA, Schettino C, Troiani T, Martinelli E, Morgillo F, and Ciardiello F. Erlotinib in cancer treatment. Annals of Oncology, 18:6 (2007), pp.
3. THUNDER ™ Phospho-ERK1/2 (T202/Y204) TR-FRET Cell Signaling Assay Kit Technical Data Sheet: https://bioauxilium.com/. com/product/phospho-erk1-2-t202-y204/