Application Note モノクロナリティ保証と細胞生存率維持にCalcein AM

Sarmad Al-Bassam, PhD | Applications Scientist | モレキュラーデバイス

抄録（Abstract）

細胞株の確立においてモノクロナリティの評価は重要であり、バイオ医薬品を市場に出すためには規制当局によるモノクロナリティの証拠が必要です。従来の最も一般的な方法は、Day 0に透過白色光（ブライトフィールド）を用いてマイクロプレートのウェルを観察し、シングルセルの存在を確認することです。しかし、播種初日のシングルセルの確実な識別は容易ではなく、細胞残渣やウェルのアーティファクトが細胞と誤認されることがあります。本稿では、蛍光試薬Calcein AMと蛍光対応CSIを組み合わせた最適化ワークフローを示し、ラベルフリー条件と同等の生存率を維持しながら、モノクロナリティの高い確信性を提供します。このワークフローでは、CloneSelect™ Imagerでシングルセルを検出するために理想的なCalcein AM濃度を決定し、クローンアウトグロースへの細胞毒性の影響を最小化します。また、異なる細胞種に対して最適な生存率染色濃度を設定するためのガイドラインを示します。

イントロダクション（Introduction）

目的のタンパク質を発現する細胞株の開発はバイオ医薬品の生成に不可欠であり、規制当局は市場投入のためにモノクロナリティの証拠を要求します。従来の方法は、Day 0に透過白色光でウェルを観察し、シングルセルの存在を確認することです。しかし、この方法には課題があり、細胞残渣やウェルのアーティファクトが細胞と誤認されることがあります。そのため、細胞株開発者は通常、コロニー状態で細胞を評価し、コロニーの起源を追跡してモノクロナリティを確認します。

代替法として、シングルセル播種前に細胞集団を蛍光標識する方法があります。本研究では、生細胞膜を通過した後に緑色蛍光を発する生存率染色試薬Calcein AM（CAM）を使用し、シングルセル検出の自動化を容易にしながら、モノクロナリティをより確実に確認します。ここでは、透過白色光（WL）ワークフローとWL＋蛍光（FL）ワークフローの違いを概説します。

結果（Results）

シングルセル検出に最適なCAM濃度の決定

信頼性の高い標識プロトコールを開発するための重要なパラメータは、細胞が検出に十分に標識されていることです。CAMの3つの濃度（0.5 μM、1 μM、5 μM）を同一条件で比較しました。5 μMおよび1 μMでは大部分の細胞が検出可能ですが、0.5 μMでは検出できません。濃度は細胞種や染色プロトコールに依存しますが、同様の希釈系列を実施することで最適な染色カバレッジを決定できます。

CAMがコロニーアウトグロースに与える影響の評価

生細胞を染色する蛍光プローブは細胞生存率に悪影響を及ぼすことが知られています。そのため、CAM（0.5 μM、1 μM、5 μM）が制限希釈後のアウトグロースに与える影響を評価しました。5 μMではアウトグロース率の低下が見られました。一方、0.5 μM、1 μM、およびラベルフリーのコントロールでは、シングルコロニーアウトグロース数に顕著な差はありませんでした。

結論（Conclusion）

• 蛍光対応CloneSelect Imagerシステムを用いてCalcein AM蛍光生存率染色試薬を使用する最適化ワークフローを示しました。この方法はラベルフリー条件と同等の生存率を維持しながら、モノクロナリティの高い確信性を提供します。
• Calcein AMの1 μMは、CloneSelect Imagerでシングルセルを検出するのに理想的であり、細胞毒性を誘発しません。他の染色試薬、細胞種、イメージングシステム、実験条件に対しても同様のアッセイ最適化ステップが必要です。
• 蛍光を用いたモノクロナリティ確認は、シングルセルを手動で識別するために必要な時間を大幅に短縮する利点があります。解析はDay 0に即座に実施でき、ワークフローの早期段階でモノクロナリティに関する情報を提供します。

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