Application Note 蛍光ラベル不要：
自動イメージングによる細胞カウント

はじめに

Jayne Hesley｜イメージングアプリケーションサイエンティスト｜モレキュラーデバイス

多検体マイクロプレート内の細胞数を正確に定量できることは、細胞の健康状態や増殖を評価するさまざまな生物学的アプリケーションにおいて重要です。これらのアプリケーションでは、蛍光染色された核をイメージングするエンドポイントアッセイを用いる場合もあれば、非染色の生細胞または固定細胞に対する透過光イメージングの高い再現性が求められる場合もあります。いずれの場合も、ソフトウェアによる細胞のセグメンテーションを通じた細胞数のカウントは、高速かつ信頼性の高いものである必要があります。ImageXpress® Pico 自動細胞イメージングシステムと CellReporterXpress™ 画像取得・解析ソフトウェアは、蛍光染色細胞にもラベルフリー細胞にも対応した細胞定量に最適です。本アプリケーションノートでは、ユーザーが選択可能な透過光セグメンテーション（解析）アルゴリズムが、多様な細胞種のカウント精度をどのように向上させるかを示し、核染色を用いた場合の結果との比較を行います。

方法

本実験では、複数の細胞種を96ウェルプレートに1:2の段階希釈で播種し、一晩培養しました。その後、37°C、5% CO₂のインキュベーター内で、5 µMのHoechstまたはDRAQ5による核染色を30～60分間行いました。プレートは、ImageXpress Pico システムを用いて、4xまたは10xのPlan Fluor対物レンズで1ウェルあたり1視野を撮影しました。蛍光画像と透過光画像は連続して取得され（透過光が先）、細胞数はオンザフライ解析によりカウントされました。オンザフライ解析とは、画像取得と同時に解析を実行する機能です。

細胞に最適な透過光モジュールを選択

CellReporterXpress ソフトウェアには、透過光画像から細胞をカウントするための3種類のモジュールが搭載されています。「Transmitted Light Cell Count, General」モジュールは、過度にコンフルエントでも希薄でもない、CHO、HeLa、PC-12などの単層培養細胞に対して良好に機能します。しかし、図1で示す実験では、細胞を96ウェルプレートに播種する際、完全にコンフルエントな状態から、1ウェルあたり数個の細胞しか存在しない状態まで、さまざまな密度で播種しました。これに対応する透過光モジュールは、最も広い細胞密度範囲において、核染色を用いた定量結果と最もよく一致する細胞数を示しました。HepG2のようにクラスター状に増殖する細胞では、高密度条件下で正確なセグメンテーションが難しい場合があります。そのため、より正確な結果を得るには、「Cell count（細胞数）」ではなく「Area covered（被覆面積）」の測定を使用することが推奨されます。

接着細胞または浮遊細胞のカウント

接着性の単層細胞や浮遊細胞は、細胞サイズに基づいた3種類の透過光（TL）細胞カウント解析プロトコール、または蛍光染色された核を検出する「Cell Count」モジュールを用いて定量することができます（図2および図3）。染色された核と非染色細胞の検出結果を比較したところ、過度にコンフルエントでないウェルにおいては、両者の結果が一貫して一致していることが確認されました（図4）。

プレート全体のサムネイル画像を使用してピペッティングアーティファクトを検出

プレート全体は、低倍率の透過光（または染色されている場合は蛍光）でスキャンすることができます。CellReporterXpress ソフトウェアを使用することで、細胞層の不均一性を示すウェルを視覚的に確認することも、オンザフライで検出することも可能です（図5）。

結論

ImageXpress Pico システムは、付属の CellReporterXpress ソフトウェアと組み合わせることで、オンザフライ解析に対応した論理的なワークフローにより、多様な生細胞および固定細胞の定量を可能にします。低倍率スキャン法を使用することで、播種の均一性を即座に確認することができます。さらに、化合物処理や試薬添加による細胞密度への影響を観察することで、実験結果の検証精度をさらに高めることができます。