Application Note 自動イメージングを用いて
蛍光ラベルの有無にかかわらず細胞をカウントする

はじめに

ジェイン・ヘスレー｜イメージングアプリケーションサイエンティスト｜モレキュラーデバイス

マルチウェルマイクロプレート内のセル数を正確に定量する能力は、細胞の健全性や増殖を研究する多くの生物製剤を可能にします。これらのアプリケーションは、蛍光染色された核をイメージングするエンドポイントアッセイを利用する場合もあれば、染色されていない生細胞や固定細胞のロバスト性透過光イメージングを必要とする場合もあります。いずれの場合も、ソフトウェアによるセグメンテーションによるセルの列挙は、迅速かつ信頼性の高いものでなければなりません。ImageXpress® Pico 自動細胞イメージングシステムと CellReporterXpress™ 画像取得・解析ソフトウェアは、標識不要、蛍光染色を問わず、細胞の定量化に最適です。このアプリケーションノートでは、透過光セグメンテーション（解析）アルゴリズムをユーザーが選択することで、多様な細胞タイプの計数精度がどのように向上するかを示し、核染色を使用した場合の結果と比較します。

方法

以下の実験では、いくつかのセルタイプを1:2連続希釈で96ウェルプレートにプレーティングし、一晩増殖させた後、37℃、5% CO2のインキュベーター内で30～60分間、5μM HoechstまたはDRAQ5核染色で標識した。プレーティングはImageXpress Picoシステムで、4倍または10倍のPlan Fluor対物レンズを用い、1視野/ウェルで読み取った。蛍光イメージャーと透過光イメージャーを連続して取得し（透過光が先）、On-the-fly解析で細胞をカウントした。On-the-fly解析は、画像取得中の同時解析を可能にする。

あなたのセルに最適な透過光モジュールをお選びください。

CellReporterXpressには、透過光で細胞をカウントするための3つのモジュールが含まれています。"Transmitted Light Cell Count, General "は、コンフルエント過ぎず、疎ら過ぎないほとんどの細胞単層培養（CHO、Hela、PC-12）に有効です。しかし、図1で報告された実験では、細胞は96ウェルプレートにプレーティングされ、完全にコンフルエントな状態から、1ウェルあたり数細胞しかない状態まで様々でした。対応するTLモジュールは、最も広い範囲の細胞密度で、核染色を用いた定量と最もよく一致する細胞数をもたらした。HepG2のように塊状に増殖する細胞では、高密 度での正確なセグメンテーションが困難な場合があ るため、より正確な結果を得るには、「セル数」ではなく「覆 面積」の測定を使用することが推奨される。

接着細胞または浮遊細胞のカウント

接着細胞単層または浮遊細胞は、細胞サイズに基づく3種類の透過光（TL）細胞計数分析プロトコルの1つ、または蛍光染色した核を検出するセルカウントモジュールを用いて定量することができた（図2および3）。染色核を用いて検出された細胞と非標識細胞の比較は、過度のコンフルエントでないウェルで一貫していた（図4）。

プレート全体のサムネイル画像を使用したピペッティングアーチファクトの検出

透過光（染色されている場合は蛍光）でプレート全体を低倍率でスキャンすることができます。細胞層の不均一性を示すウェルは、CellReporterXpress ソフトウェア（図 5）を用いて目視で確認したり、その場で検出することができます。

結論

ress Picoシステムは、付属のCellReporterXpressソフトウェアによるOn-the-fly解析をサポートする論理的なワークフローで、様々な生細胞や固定細胞の定量を可能にします。低倍率スキャン法を使用することで、プレーティングの均一性を即座に品質チェックすることができます。さらに、化合物処理や試薬添加による細胞密度への影響を観察することで、実験結果をより高いレベルで検証することができます。