Application Note AI画像解析によるラベルフリー
ライブセルモニタリング：iPSC・3D培養

はじめに

Angeline Lim, PhD | Applications Scientist | モレキュラーデバイス
Misha Bashkurov, PhD | Product Owner | モレキュラーデバイス
Oksana Sirenko, PhD | Sr. Scientist | モレキュラーデバイス

オルガノイドや患者由来スフェロイドなどの複雑な3D生物モデルは、生体組織をより忠実に再現できるため、多くの生物医学研究分野で注目を集めています。これらの3Dモデルは、疾患モデル化、創薬スクリーニング、毒性試験、宿主-微生物相互作用、そしてプレシジョンメディシンにおいて大きな可能性を秘めています *1。オルガノイドを大規模スクリーニングに利用するためには、大量のサンプルを処理し、一貫性と再現性の高いiPSC株およびそれらから誘導されたオルガノイドを培養するために、自動化が不可欠です。

自動培養システムの主要な要件は、ライブ組織をモニタリングできることです。インキュベーターやイメージングにアクセスするロボットアームなどの自動化機能を備えたワークセルは、定期的なイメージングによる細胞モニタリングに利用できます。画像から得られる定量的な読み出し（細胞培養のコンフルエンシー、iPSCコロニーサイズ、オルガノイドのサイズや形状）は、細胞継代などの後工程の自動化プロセスをトリガーする意思決定指標として、またはエンドポイントアッセイや品質管理に活用できます。

細胞をモニタリングするため、明視野イメージングは蛍光イメージングに比べてシンプルで光毒性が低いため、一般的に選択されます。しかし、明視野画像はコントラストが低く、背景が高いまたは不均一で、エッジ効果が生じやすいという課題があります。これらの問題は、解析のための高精度な画像セグメンテーションを妨げる要因となります。

機械学習または人工知能（AI）は、既存データのパターンを人間の介入の有無にかかわらず識別できる一連の計算アルゴリズムを指します。機械学習アルゴリズムは、クラスを識別するためのルールを自動的に推論します *4。

ディープラーニングは、人工ニューラルネットワーク（ANN）を用いて入力と出力の関係を学習する機械学習の一形態です。ANNは複数の「ニューロン」または計算セルからなる層で構成された数学モデルです *5。

近年、画像解析におけるAIの採用は多くの研究分野で急速に進んでいます。AIの一種であるディープラーニングは、医療、病理、生物学的イメージングにおいて成功裏に利用されています *2。バイオイメージ解析では、ディープラーニングを用いて画像セグメンテーションやオブジェクト追跡のために生画像を強化できます。従来の画像解析では、対象オブジェクトをセグメント化して定量化するために固定パラメータを定義しますが、実験条件の高い変動性により、これらの事前定義パラメータはすべての実験で機能しません。ハイスループット環境で膨大な画像データに対して解析プロトコールを手動で調整することは現実的ではありません。

これらの課題を克服するため、私たちは画像セグメンテーション用AIツール（SINAP）とオブジェクト分類ツール（Phenoglyphs）を使用し、iPSCコロニー、オルガノイド、スフェロイドの画像解析を自動化しました。IN Carta®画像解析ソフトウェアは、画像解析ワークフローにAIツールを含む直感的なユーザーインターフェースを提供します。ディープラーニングベースのSINAPは、最小限の手動操作で複雑な対象物（例：幹細胞コロニーやオルガノイド）を高精度に検出します。解析結果には形態、強度、テクスチャの測定値が含まれます。さらに、機械学習ベースのPhenoglyphsを用いてデータ分類も可能です。 本稿では、AIベースのオブジェクト検出と表現型解析を、3つの複雑な細胞モデル（iPSCの増殖、3D肺オルガノイドの発達、抗がん剤の腫瘍オルガノイドへの影響）に適用した事例を示します。これらの結果は、ディープラーニング画像解析手法をハイコンテント自動化ワークフローに統合することで、高品質なiPSCやオルガノイドを大規模に生成し、後工程に活用できることを強く支持します。

材料と方法

画像取得と解析

すべての画像は、ImageXpress® Micro Confocal ハイコンテントイメージングシステム（モレキュラーデバイス）を使用し、MetaXpress® ハイコンテント画像取得・解析ソフトウェアで取得しました。iPSCコロニーは比較的平坦で明視野ではコントラストが低いため、コロニーのエッジでコントラストを高めるために約100 µmのオフセットでイメージングしました。肺オルガノイドについては、4X対物レンズでZスタック画像を取得し、「ベストフォーカス」プロジェクションを選択しました。スフェロイドについては、10X対物レンズでZスタックイメージングを行い、「ベストフォーカス」プロジェクション画像を選択しました。

解析はすべてIN Cartaソフトウェアで実施しました。MetaXpressソフトウェアの「IN Cartaへのエクスポート」機能を使用して画像をインポートしました。SINAPを用いてすべての画像のセグメンテーションを実行しました。各モデルは解析プロトコールで使用する前にトレーニングと検証を行いました。解析後、Classifierツールを使用して特定の測定値に基づいてグループを作成しました。より複雑なデータセットでは、機械学習ベースのPhenoglyphsを使用して表現型クラスを作成しました。

細胞培養

肺オルガノイド： 3D肺オルガノイドは、ヒト肺上皮細胞（ScienCell）から誘導しました。細胞はScienCellプロトコールに従って2Dで培養・増殖しました。3Dオルガノイド培養には、PneumaCult™ Airway Organoid Kit（STEMCELL Technologies）をメーカーのプロトコールに従って使用しました。簡単に言うと、細胞を90% Matrigel（Corning）ドームに播種し、24ウェルプレートフォーマット（1ウェルに1ドーム）で培養しました。播種後は、PneumaCult Airway Organoid播種メディアを用いて2週間、隔日で給餌しました。その後、PneumaCult Airway Organoid分化メディアを用いてさらに6週間分化を行いました。

iPSC培養： フィーダーフリー条件に適応したヒトiPSC（SC102A-1、System Biosciences）を解凍し、Complete mTeSR™ Plus培養メディア（STEMCELL Technologies）を用いてMatrigelコートプレート（Corning, Cat.#354277）で培養しました。培地は毎日交換しましたが、週に1回は倍量の培地を追加し、翌日の交換をスキップしました。細胞は、酵素不使用のReLeSR™（STEMCELL Technologies）を用いて1:6～1:10の分割比で継代しました。

スフェロイド培養： スフェロイドは、原発腫瘍由来のTU-BcX-4IC細胞から形成しました。これらの細胞は、TNBCサブタイプを持つ化生性乳がんに分類されます。TU-BcX-4IC細胞を384ウェルULAプレート（Corning）に1ウェルあたり2000～4000細胞で播種し、72時間インキュベートしました。その後、スフェロイドに化合物を処理し、1日目、3日目、5日目にモニタリングしました。

結果

ディープラーニングベースの画像セグメンテーションモデル

自動化された画像解析は、ほとんどの自動イメージングプラットフォームに不可欠です。細胞やオルガノイドをリアルタイムでモニタリングし、有意な情報を抽出する能力は、ラベルフリー透過光画像の高精度な解析に依存します。明視野画像の解析に伴う課題には、低コントラスト、高背景、イメージングアーティファクトがあります（図1A）。明視野でイメージングされたオブジェクトをセグメント化するために、固定されたグローバルパラメータセットが成功することはほとんどありません。機械学習の最近の進歩により、画像解析ワークフローが改善され、複雑なデータセットでより高精度な画像セグメンテーションが可能になっています。ここでは、ディープラーニングモデルを幹細胞生物学、3Dオルガノイド、スフェロイドなどのさまざまな生物モデルの解析にどのように利用できるかを示します。

iPSC培養の経時的成長モニタリング

iPSC培養には毎日の給餌と、形態を確認するための頻繁な視覚検査が必要です。継代はコロニーサイズと分布によって決定されるため、iPSC培養の成長をモニタリングすることが重要です。ここでは、明視野イメージングと機械学習ベースの画像セグメンテーションを用いて、培養6日間にわたる個々のiPSCコロニーサイズをモニタリングしました（図2）。

3D肺オルガノイドの解析

3Dオルガノイドは、多くの生物医学的応用において強力なモデルです。患者由来で作製できるため、創薬や個別化治療に大きな可能性を秘めています。オルガノイドは数か月間培養されることがあるため、オルガノイドの状態をモニタリングする能力は品質管理やタイムラプス研究に不可欠です。

ここでは、Matrigelドームで培養し、明視野で撮像した肺オルガノイドの例を示します（図3）。面積、直径、形状係数、テクスチャ、強度などの測定値を用いて、オルガノイドの成長と分化をモニタリングできます。

患者由来腫瘍スフェロイドの化合物処理のセグメンテーションと分類

患者由来腫瘍スフェロイドは、創薬やプレシジョンメディシンにおいて治療化合物を特定するために利用できます。TNBCサブタイプを有する原発腫瘍由来細胞を培養し、抗がん化合物で処理しました。スフェロイドの処理効果は時間経過でモニタリングしました（図4）。さらに、明視野画像に基づき、複数のスフェロイド表現型が観察されました。未処理スフェロイドは明確なエッジを持つ密集構造を示す一方、処理後のスフェロイドは不明瞭で「拡散した」エッジを示します。IN Carta® Phenoglyphsソフトウェアモジュールは、スフェロイドの形態、強度、テクスチャに基づいて表現型クラスターを識別する機械学習ベースの分類ツールです。このアプローチは、将来のスクリーニングで化合物効果を迅速に特定するために利用できると考えられます。

結論

• 複雑な画像やデータセットの解析におけるAI対応アプローチは、ハイコンテントイメージングワークフローにおいて高精度な結果を提供します。
• SINAPは、ラベルフリーの生物モデルを高精度にセグメント化するためのカスタムディープラーニングモデルを簡単に作成できるユーザーフレンドリーなツールです。
• Phenoglyphsは、患者由来スフェロイドなどの複雑なデータセットに適用可能な、直感的な機械学習ベースの表現型プロファイリングを実現します。
• SINAPとPhenoglyphsは、IN Cartaソフトウェアに搭載された補完的なAIツールであり、複雑な生物学的課題とAIによる解決策の間のギャップを埋めるエンドツーエンドソリューションを提供します。

参考文献

1. Clevers H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 2016;165(7):1586–97.
2. Meijering E. A bird’s-eye view of deep learning in bioimage analysis. Comput Struct Biotechnol J. 2020;18:2312-2325. Published 2020 Aug 7. doi:10.1016/j.csbj.2020.08.003
3. Chang TC, Matossian MD, Elliott S, et al. Evaluation of deacetylase inhibition in metaplastic breast carcinoma using multiple derivations of preclinical models of a new patientderived tumor. PLoS One. 2020;15(10):e0226464. Published 2020 Oct 9. doi:10.1371/journal.pone.0226464
4. Kan A. Machine learning applications in cell image analysis. Immunology and Cell Biology. 2017; 95: 525-530.
5. Midtvedt B, Helgadottir S, Argun A, et al. Quantitative digital microscopy with deep learning. Applied Physics Reviews. 19 February 2021, DOI: 10.1063/5.0034891