Application Note PyroGene リコンビナントFactor Cアッセイによる
エンドトキシン検出
- 動物由来成分を使用せず、単一の酵素ステップでエンドトキシンを測定するアッセイでサンプルの安全性を確保できます
- SpectraMax プレートリーダーで、最小要件を超える高感度を実現できます
- SoftMax Pro ソフトウェアのワークフローで、リード・インキュベート・リードのシーケンスを自動化し、時間を節約できます
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Caroline Cardonnel ｜Sr.アプリケーションサイエンティスト｜モレキュラーデバイス
はじめに
製薬業界や医療機器業界において、製造工程中にサンプルのコンタミネーションをモニタリングすることは重要なステップです。グラム陰性菌の細胞壁に存在するエンドトキシンは、発熱、炎症、頭痛、吐き気、さらには死に至ることもある頻繁なコンタミナントです。エンドトキシンは、カブトガニ（Limulus polyphemus）の血液から得られる中心的な試薬を用いるLimulusアメーバサイトリセート（LAL）アッセイによって日常的に検出されています。エンドトキシンの存在下では、LALは酵素カスケードを介して凝固し、濁度測定法または比色法で定量できます（図1A）。これらの方法は複数の酵素ステップを含み、カブトガニの供給に依存しています。
Lonza社のPyroGene™ リコンビナントFactor C（rFC）アッセイは、単一の酵素ステップで動物由来成分を使用せずに動作し、LAL法と同等の感度を提供する定量アッセイです。エンドトキシンの存在下では、活性化されたrFCが蛍光基質を切断し、エンドトキシン量に比例した蛍光シグナルの増加を引き起こします（図1B）。
図1. LAL（A）およびPyroGene rFCアッセイ（B）の酵素カスケード
*rFCアッセイは単一の酵素ステップで構成され、カブトガニ由来のLALを必要としません。
材料
- PyroGene Recombinant Factor C Endpoint Fluorescent Assay (Lonza)
- LAL 試薬グレード ™ マルチウェルプレート (Lonza)
- パイロジェンフリー希釈チューブ（Lonza）
- LAL試薬水（Lonza）
- SpectraMax i3またはi3xマルチモードマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス：蛍光検出機能を備えた他のSpectraMaxマイクロプレートリーダーも適しています）
- SoftMax Proソフトウェア（モレキュラーデバイス）
方法
キットに付属する凍結乾燥E. coli O55:B5エンドトキシンは、バイアルに記載されたLAL Reagent Waterの量で再構成し、20 EU/mLのストック溶液を得ました。バイアルはボルテックスミキサーで15分間高速で振とうし、完全に再構成しました。以下の濃度の標準液を、ストック溶液をLAL Reagent Waterで希釈し、各希釈ごとに強く振とうして調製しました：5 EU/mL、0.5 EU/mL、0.05 EU/mL、0.005 EU/mL、0.001 EU/mL。PyroGeneアッセイは0.005 EU/mLから5.0 EU/mLまで直線性を示すように最適化されていますが、SpectraMax i3 プレートリーダーの感度を確認するため、追加の標準濃度（0.001 EU/mL）を含めました。
プレートリーダーの温度は37°Cに設定し、測定前に37°Cに到達させました。ブランクまたはエンドトキシン標準液100 μL（三重測定）をマイクロプレートのウェルに添加しました。プレートはリーダー内で最低10分間、37°Cでプレインキュベートしました。
プレインキュベーション中に、蛍光基質、アッセイバッファー、rFC酵素溶液をそれぞれ5:4:1の比率で混合し、ワーキング試薬を調製しました。10分間のプレインキュベーション後、各ウェルにワーキング試薬100 μLを添加しました。
SpectraMax i3 プレートリーダーの温度はアッセイ全体を通じて37°Cに維持しました。ワーキング試薬添加後、タイムゼロでプレートを読み取り、設定は表1に示すとおりです。SoftMax Pro ソフトウェアでPMTゲインを「自動」に設定することで、感度設定を決定する必要なく、全サンプル範囲で正確な結果を得ることができます。プレート高さの最適化を最初に実施し、以降の測定には最適化された2 mmの読み取り高さを使用しました。
| Parameter | Setting |
|---|---|
| Optical configuration | Monochromator |
| Read mode | FI (Fluorescence) |
| Read type | Endpoint |
| Wavelength |
Ex: 380 nm, bandwidth 15 nm Em: 440 nm, bandwidth 25 nm |
| Plate type |
96 Well Costar clear |
| Read area |
(user selected) |
| PMT and optics |
PMT Gain: Automatic Flashes per read: 6 Read from Top (default) Read Height: 2 mm |
表1. SoftMax Pro ソフトウェアにおけるSpectraMax i3 プレートリーダーの測定設定
PMTゲインを「自動」に設定することで、プレートリーダーの感度設定を決定する必要がなくなります。
最初の（T0）読み取り後、プレートはリーダー内で37°Cで1時間インキュベートし、同じ設定で2回目の読み取りを行いました。リード・インキュベート・リードのシーケンスは、SoftMax Pro ソフトウェアのワークフロー機能を使用して自動化できます（図2）。
図2. SoftMax Pro ソフトウェアでのワークフロー設定
タイムゼロでの初回読み取り後、1時間の遅延（インキュベーション）を挟み、再度プレートを読み取ります。ワークフロー開始前に装置は37°Cに設定されています。
2回目（T₆₀）のプレート読み取り後、各標準液の正味ΔRFUは次の式で計算しました：
$$ (\text{STD}_{T60} - \text{STD}_{T0}) - (\text{BL}_{T60} - \text{BL}_{T0}) $$
ここで…
- STD T60 = 標準液の1時間後のRFU
- STD T0 = 標準液のタイムゼロのRFU
- BL T60 = ブランクの1時間後のRFU
- BL T0 = ブランクのタイムゼロのRFU
結果
SpectraMax i3 プレートリーダーでPyroGeneアッセイを実施する適性を示すため、SoftMax Pro ソフトウェアで正味ΔRFUの対数と濃度の対数をプロットし、標準曲線を作成しました（図3）。
図3. PyroGene rFCアッセイの標準曲線
標準曲線はSoftMax Pro ソフトウェアでログ-ログカーブフィットを使用して作成され、0.001 EU/mLから5 EU/mLまでのコントロール標準エンドトキシンの5段階希釈（二重測定）で構成されました（R²=0.996）。
アッセイは0.001 EU/mLから5 EU/mLまでの5段階のエンドトキシン希釈で実施しました。二重測定のCVは5%未満でした。R²値が0.996であることから、標準曲線はこの拡張濃度範囲全体で優れた直線性を示しました。SpectraMax i3 プレートリーダーは、製品インサートで推奨される範囲（0.005 EU/mL～5.0 EU/mL）よりも低い濃度のエンドトキシンを検出でき、蛍光アッセイでのエンドトキシン検出感度が向上していることを示しました。
結論
複製間のばらつきが少ない直線的な標準曲線の生成と、アッセイの推奨下限検出限界を下回る感度は、PyroGene リコンビナントFactor Cアッセイを用いたSpectraMax i3 マルチモードマイクロプレートリーダーの優れた性能を示しています。同様の結果はSpectraMax i3xプレートリーダーや蛍光検出機能を備えた他のSpectraMaxプレートリーダーでも得られます。
SoftMax Pro ソフトウェアはデータ解析に使用され、計算された正味ΔRFU値を用いて標準曲線をプロットし、R²値を生成し、このリーダーが非常に低いエンドトキシンレベルを検出する感度を示しました。
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