Application Note エンドトキシン検出を効率化
Kinetic-QCL LALアッセイの特長と利点

Joyce Itatani | Application Scientist | モレキュラーデバイス
Cathy Olsen, PhD | Sr. Applications Scientist | モレキュラーデバイス

はじめに

製薬業界や医療機器業界において、製造工程でコンタミネーションを監視することは重要なステップです。頻繁に検出されるコンタミナントであるエンドトキシンは、発熱、炎症、頭痛、吐き気、さらには死に至ることもあります。エンドトキシンはグラム陰性菌の細胞壁に存在し、従来から高感度かつ特異的なLimulus Amebocyte Lysate（LAL）アッセイによって検出されてきました。エンドトキシンの存在下では、LALは酵素カスケードを介して凝固し、その後ゲル化や濁度に基づいて定量されるのが一般的でした。

LonzaのKinetic-QCL™ キネティック比色 LALアッセイは、LALエンドトキシン反応の初期段階を利用し、合成基質からp-ニトロアニリン（pNA）を遊離させる酵素を活性化し、405 nmで吸光度測定可能な黄色の発色を生成します。この比色法は、濁度測定アッセイにおける凝固機構に干渉する阻害性製品の試験に適しています。この吸光度はマイクロプレートリーダーで測定でき、サンプル中のエンドトキシン濃度に比例します。ここでは、SpectraMax® Mini マルチモードマイクロプレートリーダーを用いたエンドトキシン定量の方法を紹介します。

材料

• カイネティックQCL™
• Kinetic Chromogenic LAL Assay (Lonza)には以下の試薬が含まれます：
  ・カイネティックQCL試薬
  ・LAL試薬水
  ・ 大腸菌 O55:B5 エンドトキシン（本キットのコントロール標準エンドトキシン）
• 96-well 透明 LAL 試薬グレードマルチウェルプレート（Lonza）
• パイロジェンフリー希釈チューブ（Lonza）
• SpectraMax Miniマルチモードマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス)

方法

SpectraMax Miniプレートリーダーは、アッセイ設定前にSoftMax Proソフトウェアのユーザーインターフェースを介して37°Cに加温しました。

コントロール標準エンドトキシンは、キットに添付された分析証明書に記載された手順に従い、LAL試薬水（LRW）で再構成し、50 EU/mLの溶液を得ました。バイアルは15分間強くボルテックスしました。Kinetic-QCL試薬はキットの指示に従ってLAL試薬水で再構成し、泡立ちを避けるために穏やかにスワールしました。

エンドトキシン標準液は、使い捨てエンドトキシンフリーガラス希釈チューブで調製しました。LRW中で5 EU/mLから0.005 EU/mLまでの1:10希釈系列を作成しました。各標準液100 µLをLAL試薬グレードマルチウェルプレートの複製ウェルに添加しました。マイクロプレートは、予熱したSpectraMax Miniプレートリーダー内で37°Cで10分間インキュベートしました。その後、マルチチャンネルピペッターを用いて、エンドトキシン標準液を含むマイクロプレートのウェルにKinetic-QCL試薬100 µLを分注しました。SoftMax Proソフトウェアの事前設定プロトコールを使用して、キネティック測定を直ちに開始しました。設定は表1に示します。405 nmでの吸光度データは2時間にわたり1分ごとに取得され、ソフトウェアのプレートセクションにリアルタイムで表示されました。間隔や測定時間は必要に応じて調整可能です。

表1. SpectraMax MiniプレートリーダーでのLAL Kinetic-QCLアッセイの機器設定

SoftMax Proソフトウェアで自動データ処理を適用し、各ウェルの反応開始時間（オンセットタイム）を算出しました。オンセット光学濃度（OD）はキットマニュアルに従い0.2に設定しました。オンセットタイムは、ウェルの吸光度が指定されたOD（0.2吸光度単位）に達するまでの時間です。オンセットタイムと標準濃度をプロットし、対数-対数標準曲線を作成しました。

結果

0.005～5 EU/mLの範囲を図1に示し、オンセットタイムは赤い縦線で表示しました。各標準液の平均オンセットタイムを標準濃度に対してプロットし、SoftMax Proソフトウェアで対数-対数曲線フィットを適用しました（図2）。

図2. エンドトキシン標準曲線。平均オンセットタイム（秒）とエンドトキシン標準濃度をSoftMax Proソフトウェアで対数-対数曲線フィット（n = 2, r² = 0.987）

LAL Kinetic-QCLアッセイマニュアルによる性能要件は以下の通りです：

• 計算された標準曲線の相関係数（r）の絶対値は≥ 0.980
• 標準複製のオンセットタイムの%CVは10%未満

SpectraMax Miniプレートリーダーで生成された標準曲線では、SoftMax Proソフトウェアが算出したr²値は0.987で、要件を満たしました。標準の複製に対する%CVは各標準で4%未満でした（表2）。

表2. SoftMax Proソフトウェアの標準グループテーブルで算出された値。各標準の%CVは10未満で、LAL Kinetic-QCLアッセイの再現性要件を満たしました。

注：SpectraMax ABS Plusマイクロプレートリーダーでも同等の結果が得られました（データ非表示）。

結論

複製間のばらつきが少ない線形標準曲線の生成と、アッセイの下限検出感度までの高い感度は、SpectraMax MiniプレートリーダーとLAL Kinetic-QCLアッセイが試験サンプル中のエンドトキシン検出に適していることを示しています。SoftMax Proソフトウェアは、サンプルのオンセットタイムに基づき、標準曲線から未知試料のエンドトキシン濃度を自動的に補間できます。