Application Note SpectraMaxマイクロプレートリーダーを
用いたDNAおよびRNAの吸光度測定

はじめに

モレキュラーデバイスが初めてUV対応のマイクロプレートリーダーを発売した時、マイクロプレートでの紫外線（UV）測定が可能になりました。それ以来、DNA、RNA、タンパク質のマイクロプレート測定は非常にポピュラーになりました。しかしながら、マイクロプレートアッセイでは、特にUV領域で正確な吸光度結果を得るために、マイクロプレート材料の光学特性を認識し、従来のキュベットよりも技術に注意を払う必要があります。このような細部への注意が欠けていることが、アッセイをマイクロプレートに適合させることを困難にする最も頻繁な原因です。

マイクロプレートによる吸光度測定は光路長のばらつきがあり、気液界面での表面効果による干渉を受けやすいです。最新のマイクロプレートリーダーは、旧式のワイドビームプレートリーダーよりも光ビームが小さいため、ホコリによるスプリアスの影響を受けやすいです。読み取り時に光ビームの中に粒子があると、最大0.3 ODのアーティファクト吸光度スパイクを引き起こす可能性があります。したがって、サンプル溶液に粒子がないことが特に重要です。マイクロプレートで正確で再現性のある吸光度結果を得るためには、上記のすべての要因に留意する必要があります。ここでは、SpectraMax®マイクロプレートリーダーでDNA/RNA吸光度測定を最適化するためのガイドラインを示します。

材料と方法

• SpectraMaxマイクロプレートリーダー（UV吸光度検出付き）（モレキュラーデバイス）
• UV透過マイクロプレート
  ⚪︎使い捨て： コーニングまたはGreiner
  ⚪︎石英: Hellma

最高品質のDNA吸光度値を得るための推奨事項

1. 清潔なマイクロプレートと粒子のない溶液を使用する。バッファーをフィルタリングして（例えばポアサイズ < 5 µm）微粒子を除去し、最良の結果を得るために、使い捨てマイクロプレートを再使用しない。すぐに読み取らない場合は、マイクロプレートに蓋をしてください。
2. バッファーブランクの吸光度値を記録します（少なくともトリプリケートでブランクを含める）。ブランク値が期待される範囲に入らない場合は、マイクロプレートの汚れ、ウェル内の微粒子、またはマイクロプレートの欠陥が原因である可能性が最も高いです。使い捨てUVマイクロプレートのプレーティングバックグラウンドOD値は、ロット間でわずかに異なります。新しいロットのきれいな水を満たしたプレートを読み取ることで、予想される平均OD値を決定する必要があります。表 1 に、UV 透明マイクロプレートの OD260 と OD280 の概算値と標準偏差（SD）を示します。コーニング UV プレートとグライナー UV プレートのバックグラウンド OD 値は、石英マイクロプレートとほぼ同等です。
3. 低吸収サンプルの場合は、最大光路長（したがって最大吸光度）を得るために最大容量（250～300 µL）を使用します。可能であればデュプリケートまたはトリプリケートも使用します。左右対称のメニスカス形成を促すため、プレートを短時間オートミックスします。
4. 少量のサンプル（1～20 µL）と希釈液を使用する場合は、少量のサンプルを最初にウェルにピペッ トし、次に少量のサンプルをウェルにピペッ トします。SpectraMaxインストゥルメンテーションで10～20秒間自動混合し、混合を完了します。少量の試料を最後に添加した場合、混合が不完全なため、結果に大きなばらつきが生じることがあります。
5. イオン強度を上げると吸光度が低下することに注意してください *1,*2。DNAを水ではなくTEバッファー生理食塩水に溶解すると、吸光度が約23%低下します（図2）。最高の感度を得るためには、DNAサンプルは脱イオン水に溶かす必要があります。

表1. 260 nmおよび280 nmにおけるマイクロプレートの光学濃度。値は清浄なプレート5枚の平均値で、各プレートには200 µLの水が満たされています。*コーニングUVプレートでは、波長260 nmの平均値はロット番号により0.046～0.057の範囲でした。

PathCheckを使用して吸光度値を1cmの光路長に正規化する

SpectraMaxマイクロプレートリーダーにはPathCheckテクノロジーが搭載されていて、マイクロプレートの各ウェルの光路長を測定し、吸光度値を1cmの光路長に正規化することで、1cmのキュベットで得られた値と同じにします。

$$ A_{\text{Sample per cm}} = \frac{A_{\text{Sample}}}{\text{pathlength}_{\text{Sample}}\,(\text{cm})} $$

光路長を正規化する前に、マイクロプレート自体の OD を考慮する必要があります。マイクロプレート内のサンプルの生のODは以下の通りです：

$$ OD_{\text{Total}} = A_{\text{Sample}} + A_{\text{Blank}} + OD_{\text{microplate}} $$

ASampleとABlankはどちらも経路長に依存します。ODmicroplateはマイクロプレート材料のODと表面からの反射によるもので、経路長に依存しません。したがって、上記の最初の式で経路長正規化吸光度値を計算する前に、まずこれを差し引く必要があります。SoftMax® Proには、ODmicroplateを減算するための2つのオプションがあります。サンプル量が変動する場合は、オプション1を推奨します。すべてのウェル容量が同じ場合は、ODmicroplateを通常の試薬ブランクに含めることができます（オプション2）。

PathCheckの計算でマイクロプレートのODを除去するオプション

オプション1：プレーティングバックグラウンドODを使用します

(バックグラウンドが低く均一なマイクロプレートに推奨)。

新しいロットの使い捨て UV マイクロプレートごとに、PathCheck で使用する各波長における OD マイクロプレート（「プレートバックグラウンド OD」）を測定します。清浄なプレートにウェルあたり100～200μLの水を入れ（水は190～900nmの間で光をほとんど吸収しないため、量は重要ではありません）、プレートを読み取ります。空気は水と屈折率が異なるため、OD値が異なるので、乾いたプレートは使用しないでください。ある波長における平均ODは、その波長におけるプレートバックグラウンドODです。260 nmと280 nmにおけるODmicroplateの値は、表1に示す値と類似しているはずです。260nmでSDが0.003より大きい場合は、マイクロプレートが汚れているか、欠陥がある可能性があります。

Plate Background ODを決定したら、SoftMax ProのData Reductionダイアログボックスに入力します。通常通り、Template Editorでサンプル、標準品、ブランクの位置を指定し、それに従ってマイクロプレートに注入します。プレートを読み取ると、SoftMax Proは自動的に以下の処理を行います：

1. 生のウェル吸光度値からPlate Background ODを差し引きます。
2. すべてのサンプル、標準品、ブランクにPathCheckを適用します（Reduction*で選択を解除していない限り）。
3. 試薬ブランクを差し引きます。

*PathCheckの選択を解除すると、プレートのバックグラウンド減算も解除されます。

オプション 2: ODマイクロプレートをプレートブランクの一部に含める

すべてのウェルの容量（およびパスの長さ）が同じで、すべてのサンプルが同じ溶液でブランクされている場合に、このオプションを使用します。

設計上、SoftMax Proは経路長の正規化後にプレートブランク（試薬ブランク）を差し引きます。ODmicroplateは、すべてのサンプル量とブランク量が同一である場合（およびその場合のみ）に、プレートブランクの構成要素として差し引くことができます。

マイクロプレート内の3つ以上のウェルを選択し、ブランキング溶液（通常は水またはバッファー）を封入します。SoftMax ProのTemplate Editorで、これらのウェルを "Plate Blank "**として割り当てます。残りのウェルをサンプルおよび標準液として指定し、それに従ってプレートを準備します。プレートを読み取ると、SoftMax Proは自動的に以下の処理を行います：

1. すべてのサンプルとブランクにPathCheckを適用します（選択を解除した場合を除く）。
2. マイクロプレートの各ウェルからブランクの平均値を差し引きます。すべてのサンプルとブランクのパス長が同一であることを前提に、ODmicroplateにパス長正規化を適用する際の潜在的なエラーはキャンセルされます。

**SoftMax Proは、マイクロプレートの各ウェルからプレー トブランクウェルの平均吸光度値を差し引きます。

SpectraMaxリーダーでのDNA測定例

子牛胸腺 DNA のアリコート（水中 \( \frac{0.1\text{ー}2.0\,\mu\text{g}}{\text{mL}} \)）を、PathCheck を適用した Corning UV マイクロプレートで 260 nm で読み取りました（図 1）。計算上の検出限界（ブランク値のゼロ基準に対して、正の標準偏差（SD）3個分を超える吸光度を示す量）は約\( \frac{25\,\text{ng}}{\text{well}} \)でした。非常に保守的な基準（試薬ブランクのゼロ値を基準として、正の標準偏差（SD）10個分を超える吸光度値を示す量）を用いて計算した定量限界は、約\( \frac{75\,\text{ng}}{\text{well}} \)でした。300μLを封じ込めたウェルでは、この限界値は\( \frac{250\,\text{ng}}{\text{mL}} \)となります。より低い限界値は、より控えめな基準で達成できますが、技術に厳密な注意を払う必要があります。上記の結果は、最適条件下であらかじめ希釈した溶液を用いて得られたものです。その代わりに、各ウェルに少量の犠牲DNAサンプルと希釈液を入れるプロトコールでは、定量限界は多少高くなります。

マイクロプレートの結果は、分光光度計のA260測定によるDNAの検出限界とよく一致しています *3,*4。これは、入手可能なUV透過マイクロプレートが高品質であること、マイクロプレートウェル全体の光路長が約1cmであることを考慮すると、予想外の結果ではないです。DNA濃度が低い試料を封じ込めた場合、UV吸光度では測定できず、蛍光色素との反応など、別の手法でしか測定できないです。

吸光度を用いたDNA/RNAの推定

DNA/RNA濃度は、一般的にA260値を1cm吸光度の値で割る（またはその逆数を掛ける）ことで推定されます。PathCheckを使用すると、SpectraMaxプレートリーダーは自動的にサンプルの吸光度値を1cmの光路長に正規化し、濃度を計算することができます。260nmにおける二本鎖DNAの\( \frac{1}{\text{absorptivity}} \)の値は、一般に1cmの光路長に対して\( \frac{\sim 50\,\mu\text{g}}{\text{mL}} \)と仮定されています *3,*4。

しかし、この値が正しいのは、溶液の塩濃度が比較的高い場合に限られるようです（図2）。DNAはTEバッファー中では水よりも吸光度が15%低く、TE＋生理食塩水（TES）中では23%低いです。\( \frac{1}{\text{absorptivity}} \) の計算値は、水、TE、TES中のDNAについて、それぞれ\( \frac{38\,\mu\text{g}}{\text{mL}} \)、\( \frac{45\,\mu\text{g}}{\text{mL}} \)、\( \frac{50\,\mu\text{g}}{\text{mL}} \) でした（図2の挿入図）。

SoftMax Proを使用したDNA濃度の計算

DNA/RNAアッセイプロトコルでは、作業可能なサンプル量を得るために希釈剤を加えた少量（2～10 µL）サンプルのA260測定を行うことがよくあります。例えば、シークエンシングやその他のアッセイに先立ち、血液や組織サンプルからDNAを抽出する場合です。アッセイに進む前に、抽出液の少量の犠牲アリコートのDNA濃度を測定し、その結果を使用して、所望のDNA量をアッセイに移すために必要なアリコートのサイズを計算します。SoftMax Proは、SpectraMaxリーダーからのA260値を自動的に正規化し、濃度を決定し、目的のアリコートサイズを計算することができます。SoftMax Proは、0.5 µL単位で設定可能なリキッドハンドリングシステムに対応するため、0.5 µL単位で四捨五入することもできます。図3は、犠牲となる分注量が5 µLで、アッセイの目標量が0.4 µgの場合の例です。各サンプルについて公称分注量が計算され、その量も0.5 µL単位で四捨五入されました。これらの計算結果は、外部のデータ処理システムで使用するために簡単にエクスポートできます。

*400ngを移動するのに必要なアリクオットサイズ
**アリコート量は0.5 µL未満を四捨五入。

図3. DNA抽出物。SoftMax Proで作成されたレポートの例。DNA抽出物の結果と、アッセイへの移し替えなど、指定した量のDNAを封じ込めるために必要な分注量の計算結果が記載されています。

結論

技術に注意すれば、正確で再現性のあるDNA/RNA測定をマイクロプレートで簡単に行うことができます。定量下限値は、従来のUV-VIS分光光度計で得られた値に匹敵します。測定結果は、PathCheckを使用して1cmの光路長に自動的に正規化することができ、標準的な1cmの光路長のキュベットで得られた値と同等の値が得られます。SoftMax Proは、特異性のある量のDNA/RNAを封じ込めるのに必要な分注量を計算し、結果をカスタマイズしたウェルフォーマットで報告することができます。SoftMax Proには、吸光度ベースの核酸定量法用にあらかじめ設定されたプロトコルがあり、データの作成と解析が容易です。

参考文献

1. Beaven, G.H., E.R. Holiday and E.A. Johnson. 1955. Optical properties of nucleic acids and their components, p. 493–553. The Nucleic Acids, Vol. 1. Academic Press, New York. (E. Chargaff and J.N. Davidson, Eds.)
2. Wilfinger, W.W., K. Mackey and P. Chomczynski. 1997. Effect of pH and Ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. BioTechniques 22: 474–479.
3. Sambrook, J., E. Fritsch and T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. p. E.5.
4. Gallagher, S.R. 1994. Quantitation of DNA and RNA with Absorption and Fluorescence Spectroscopy. Current Protocols In Molecular Biolgy, Vol. 3. John Wiley & Sons, pp. A3.D.1–A3.D3.

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