Application Note DNAse Iの定性とサンプル処理

はじめに

Threshold Total DNA Assay は、バイオ医薬品中のコンタミ DNA を定量します。DNase I は、Total DNA Assay と併用することで、2 つの目的に使用することができます：

Total DNA アッセイによって生成されたアッセイシグナルとその後の定量が、DNA を特異的に測定しており、サンプルの非 DNA 成分を測定していないことを検証する。

観察されたTotal DNA Assayの阻害が、タンパク質やバッファーによる干渉ではなく、小さな断片DNAの存在によるものであることを確認する。

本アプリケーションノートでは、これら両方の用途に対応するための手順を説明する。また、新ロットの DNase I を適格に認定するための方法も記載されている。

DNase Iはウシの膵臓由来の37,000ダルトンのエンドヌクレアーゼで、二本鎖DNAを分解して3'-ヒドロキシルオリゴヌクレオチドを生成する。この酵素は活性のために2価の陽イオンを必要とし、反応の特異性はどの2価の陽イオンが存在するかによって決まる。Mg2+が選択されたのは、Mg2+が存在すると、DNase Iが二本鎖DNAの各鎖を独立して切断し、ランダムな切断部位を生成するからである1。

材料

1. Molecular Devices Corporation（カタログ番号 0200-0500）のThreshold®システム（1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089, tel: 408-747-1700 または 800-635-5577）。
2. Molecular Devices CorporationのTotal DNA Assay Kit（カタログ番号R9009）。
3. Molecular Devices Corporation 製 Total DNA Zero Calibrator Kit（カタログ番号 R8004）。
4. Boehringer Mannheim Corp.のウシ膵臓由来DNase I、RNaseフリー（カタログ番号776-785）。
5. Bovine serum album, Boehringer Mannheim Corp.の分子生物学用特別品質（カタログ番号 711-454）。
6. Glycerol, 超高純度分子生物学グレード、ベーリンガー・マンハイム社製（カタログ番号 100-647）。
7. EDTA、二ナトリウム塩、Sigma Chemical社から（カタログ番号E5134）。
8. MgCl2、Sigma Chemical Co.から（カタログ番号M2670）。
9. トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩、ACSグレード、Aldrich Chemical Company社から（カタログ番号85、764-5）。
10. ジチオエリスリトール(DTE.)、Aldrich Chemical Company, Inc.から(カタログ番号16,176-4)。

方法

DNase I は、熱変性前の検査用サンプルに添加される。従って、試料以外のDNAの混入を最小限に抑えるために、適切な無菌技術を実践する必要がある。滅菌済み個別包装ピペットチップ、滅菌チューブ、手袋を、この手順の間中使用する。DNase I はロット間でばらつきがあるため、サンプルに使用する前に各ロットの活性を確認することが重要である。最適なDNase Iの量は、50 pgの二本鎖DNAのスパイクの定量を少なくとも90%減少させる。遊離のMg 2+イオンが存在する場合、過剰なDNase IはTotal DNA Assayにおけるサンプルの濾過を遅らせたり、停止させたりする可能性があります。このため、消化後に各サンプルに EDTA を添加し、遊離の Mg 2+ イオンをすべてキレートする必要があります。

DNase I資格

最初の試験には、25、50、100活性単位（U）の3段階のDNase Iが推奨される。

ステップ1 DNase Iのストック溶液を2500 U/mLで以下のバッファーに調製する： 20 mM Tris-HCl、1 mMジチオエリスリトール、50 mM NaCl、0.1 mg/ mL BSA、50%グリセロール。分注し、-20℃で保存する。

ステップ2 ゼロキャリブレーターにMgCl 2の100mM溶液を調製する。0.2μmのフィルターに通した後、滅菌済みコーニング製遠心チューブに入れ、室温で保存する。

ステップ3 ゼロキャリブレーターまたは滅菌注射用水でEDTAの160mM溶液を調製する。0.2μmのフィルターに通した後、滅菌済みコーニング製遠心チューブに入れ、室温で保存する。

ステップ4 200μLのHigh Calibratorを800μLのZero Calibratorに希釈し、スパイク添加用の1ng/mL DNA溶液を調製します。

ステップ 5 二重検体チューブに以下のラベルを貼り、0.5 mLのゼロキャリブレーター（ZC）を各チューブにピペットで注入します：

DNase I適格性確認のために、合計16本のチューブが必要である。

ステップ6 25U、50U、100UのDNaseストック溶液を、各チューブにそれぞれ10μL、20μL、40μ加える。

ステップ7 スパイク添加用に指定された各チューブ（+spike）に、50μLの2本鎖1ng/mL DNA溶液を添加する。

ステップ8 100 mM MgCl 2溶液25μLを、DNase Iの入った各チューブに加える。

ステップ9 37℃で3時間インキュベートする。

ステップ10 サンプルを105℃で15分間加熱し、氷上で5分間冷却する。

ステップ11 160 mM EDTA溶液を50μLずつ、DNase Iの入ったチューブに加える。

ステップ12 Total DNA Assayで変性したサンプルを分析する。DNAスパイクを少なくとも90％減少させ、なおかつ適切な濾過が可能な最低レベルのDNase Iが最適濃度です。しかし、タンパク質の中にはDNase Iの活性を阻害するものがあるため、このようなサンプルの場合は、より高濃度のDNase Iが必要になる場合があります。

注：上記のステップ#7、8、11で概説したサンプルチューブへの添加は、滅菌済みの1.25 mL CombiTip®と滅菌済みピペットチップを個別に包装したエッペンドルフ・リピーター・ピペッターを使用して行うことができます。

サンプルの前処理

高濃度の DNA を含む可能性のある検体は、まず Threshold System Operator's Manual の Total DNA の項に記載されている希釈試験で評価する必要があります。この手順では、Total DNA アッセイ標準曲 線のダイナミックレンジ（3～200 pg/test）を超える DNA レベルが検体に含まれているかどうかを判定します。

DNase I消化は、プロテアーゼ消化の前に行う必要がある。SDSはDNase Iを阻害し、Proteinase KまたはPronaseはDNase Iを消化して不活性化する。サンプルを消化しなければならない場合は、必ず全てのZCコントロールも消化してください。

サンプルに添加するMgCl 2の総量は、サンプルバッファーに含まれるEDTAまたはMg 2+の量に依存し（存在する場合）、DNaseの活性を最大にするためには、最終サンプル濃度が5 mM Mg 2+になるように変更する必要があります。消化後、各サンプルに十分な量のEDTAが添加されていることを確認するには、サンプルバッファーにMg 2+または他の陽イオンが存在するかどうかを確認します。もしそうなら、EDTAの量を増やしてすべての陽イオンをキレートする。

全DNAアッセイの特異性の検証

ステップ1 サンプルチューブにラベルを貼り、各サンプル0.5 mLを適切なチューブに分注します：

ステップ2 200μLのHigh Calibratorを800μLのZero Calibratorに希釈し、スパイク添加用の1ng/mL DNA溶液を調製します。

ステップ3 選択したレベルのDNase Iストック溶液を、DNase I添加用に指定した各チューブに加える。

ステップ4 DNase Iの入った各チューブに、25μLの100mM MgCl 2溶液を加える。

ステップ5 スパイク添加用に指定された各チューブに、50μLの2本鎖1ng/mL DNAストックを加える（＋スパイク）。

ステップ6 37℃で最低3時間インキュベートする（タンパク質サンプルによっては、DNase消化が完了するまで一晩インキュベートする必要があります）。

ステップ7 すべてのサンプルを105℃で15分間加熱し、氷上で5分間冷却する。

ステップ8 同時に、スパイク後の添加に使用する残りの1ng/mL DNA溶液と、DNA標準曲線を作成するために使用するHigh Calibrator 500μLを熱変性させる。氷上で5分間冷やす。

ステップ9 160 mM EDTA溶液50μLを、DNase Iの入った各チューブに加える。

ステップ 10 ポストスパイク（＋ポストスパイク）用に指定された各チューブに、変性した 1 ng/mL DNA 溶液 50 μL を加える。

ステップ 11 Threshold Total DNA Assayを使用して変性したサンプルを分析します。推奨されるコントロールとサンプル条件をすべて実行した場合、アッセイには4本のスティック（3本のサンプルスティックと1本の標準曲線）を使用します。

注：上記のステップ#3、4、5、9、10で概説したサンプルチューブへの添加は、滅菌済み1.25 mLコンビチップと滅菌済みピペットチップを個包装したエッペンドルフ・リピーター・ピペッターを使用して行うことができます。

DNA断片の存在を確認する

ステップ1 サンプルチューブにラベルを貼り、各サンプル0.5 mLを適切なチューブに分注します：

酵素の活性を検証するために、DNase I を含む、または含まない、スパイクされた Zero Calibrator (ZC) コントロールが含まれています。ZC変性ポストスパイクDNAコントロールは、ポストスパイクサンプルとの比較として使用されます。変性 DNA のポストスパイクで検査したサンプルは、Total DNA Assay の阻害が DNA によるものか、タンパク質やバッファー成分などの他の阻害因子によるものかを判定するために使用されます。

ステップ2 前項のステップ2～11に従う。

データ分析

全DNAアッセイの特異性の検証

ステップ1 以下のコントロールとサンプルのネットスパイクを計算する：

ステップ2 DNase消化ZCコントロールのスパイク定量（上記のネット）と未処理ZCコントロールのスパイク定量を比較する。

正味ZC＋DNaseの定量が正味ZCの10％以下であれば、DNaseは活性があり、十分に機能している。

ステップ3 DNase消化サンプルのスパイク定量と未処理サンプルのスパイク定量を比較する。

正味サンプル＋DNaseの定量値が正味サンプルの10％以下の場合、Total DNA AssayはDNAのみを測定しています。

ステップ4 DNase消化して変性DNAをポストスパイクしたサンプルのスパイク定量と、DNase消化してポストスパイクしたZCのスパイク定量を比較する。

正味のサンプル＋DNase＋ポストスパイクが、正味のZC＋DNase＋ポストスパイクの定量値の80～120％である場合、実験を行うためにサンプルに添加した試薬は、いずれもTotal DNAアッセイに干渉しない。

DNA断片の存在を確認する

ステップ1 以下のコントロールとサンプルのネットスパイクを計算する：

ステップ2 DNase消化ZCコントロールのスパイク定量（上記ネット）と未処理ZCコントロールのスパイク定量を比較する。

正味のZC + DNaseの定量値が、スパイクしたZCの10%以下であれば、DNaseは活性であり、十分に機能している。

ステップ3 非DNase消化サンプルの正味スパイク定量と、非DNase消化ZCコントロールのスパイク定量を比較する。

サンプルがZCコントロールのスパイク回収率80%未満の場合、DNA検出が阻害されています。ステップ4に進む。

ステップ4 DNアーゼ消化、スパイク後サンプルの正味スパイク定量（DNアーゼ消化、非スパイクサンプル定量を差し引いたもの）と、DNアーゼ消化、スパイク後ZCコントロールの正味スパイク定量（DNアーゼ処理、非スパイクZC定量を差し引いたもの）を比較する。

サンプル＋DNase＋ポストスパイクがZC＋DNase＋ポストスパイクの80～120％であれば、DNA断片または過剰DNAがTotal DNA Assayを阻害している。

正味のサンプル＋DNase＋ポストスパイクが、正味のZC＋DNase＋ポストスパイクの定量値の80％未満である場合、スパイク回収の阻害は、DNA断片または高レベルのDNAではなく、緩衝液またはタンパク質の阻害によるものである可能性がある。

概要

DNase I は DNA に対して非常に特異的です。DNase I 消化により Total DNA アッセイで観察されるシグナルが除去されれば、Total DNA アッセイの特異性が確認されます。DNase I 消化で Total DNA アッセイで生じるシグナルが 90％以上減少しない場合は、Threshold System Operator's Manual に概説されている前処理法を検討する必要があります。DNA 量が 10 pg 未満の最終製品サンプルを分析する場合、特に前処理を行ったサンプルでは、バックグラウン ドに対するシグナルの 90%減少を識別することが困難な場合があることにご注意ください。DNase Iを使用することで、Threshold Total DNA Assayで観察された阻害がDNAに起因するものであるかどうかを判定することができます。

参考文献

1. Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition; Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
2. Threshold System Operator's Manual , Molecular Devices Corporation (1993).