Application Note フェノールフリーのDNA抽出法

はじめに

Threshold® Total DNA Assayで検査するバイオ医薬品サンプルの前処理として、市販の抽出キットを用いてDNA抽出法を評価しました。この抽出法には、カオトロープ、ヨウ化ナトリウム、陰イオン性洗浄剤、N-ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、イソプロパノールが含まれ、核酸を多糖担体であるグリコーゲンと共沈させます。この沈殿により、Total DNA アッセイを妨害する可能性のあるサンプル成分、タンパク質、脂質、バッファーから DNA を分離することができます。多くのタンパク質について、この抽出技術は、従来のProteinase KとSDSによる一晩の消化、および／またはフェノール／クロロホルム抽出に取って代わることができます。このアプリケーションノートでは、Thresholdユーザーの経験や、当社のアプリケーションラボでの評価結果を紹介しています。

材料

1. Molecular Devices CorporationのThreshold® System（カタログ番号0200-0500）、1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089、電話：408-747-1700または800-635-5577。
2. Molecular Devices CorporationのTotal DNA Assay Kit（カタログ番号R9009）。
3. Molecular Devices CorporationのTotal DNA Zero Calibrator Kit（カタログ番号R8004）。
4. Wako Chemicals USA, Inc. (カタログ番号 295-50201), 1600 Bellwood Rd., Richmond, VA 23237, tel: 800-992-9256, fax: 804-271-7791; または Wako Chemicals GmbH, Nissanstr. 2, W-4040 Neuss 1, Germany, tel: 49- 2131-311154, fax: 49-2131-311100.
   DNA 抽出キット 化学成分
   • ヨウ化ナトリウム溶液 (26 mL)
   • N-ラウロイルサルコシン酸ナトリウム溶液 (1.2 mL)
   • 洗浄液A (42 mL)
   • 洗浄液B (2x40 mL)
   • グリコーゲン溶液 (0.1 mL)
5. イソプロピルアルコール、組織グレード
6. マイクロフュージ (X10,000g).
7. ボルテックスミキサー
8. 滅菌済みピペットチップ
9. 滅菌済みOリング付き2.0mLコニカルチューブ（Sarstedt, Inc. Box 468, Newton, North Carolina 28658-0468, tel: 800-257- 5101, fax: 704-465-4003。
10. NUNC, Inc.の滅菌4.5mLクライオチューブ（カタログ番号363452）、2000 North Aurora Road, Naperville, Illinois 60563, tel: 800-288-6862。
11. タンパク質サンプルは、Molecular Devices社のThreshold顧客から提供されました。

方法

抽出手順はDNAを熱変性させる前に行われるため、DNAのコンタミネーションを最小限に抑えるために、無菌的技術を実践することが重要です。この手順では、滅菌したラップチップ、滅菌チューブ、手袋を使用します。可能であれば、滅菌済み個別包装のエッペンドルフ・コンビチップス（Combitips®）とエッペンドルフ・リピーター・ピペッターの併用をお勧めします。1キットには50サンプル抽出用の試薬が含まれています。

測定手順

ステップ 1 64 µL のグリコーゲン溶液をヨウ化ナトリウム溶液1に加えます。

ステップ2 洗浄液B 1本にグリコーゲン溶液2 µLを加え、軽く振り混ぜて完全に混合します2。

ステップ3 その日の抽出に必要なイソプロパノールの量を計算し、滅菌済み50 mLチューブに分注します。

ステップ4 滅菌済み2.0 mLサルステットマイクロフュージチューブ（キャップ付き）にサンプル500 µLを分注します。

ステップ5 N-ラウロイルサルコシン酸ナトリウム溶液20μLをチューブに加えます。

ステップ6 500μLのヨウ化ナトリウム溶液（グリコーゲン溶液を含む）を加えます。キャップをし、5～15秒間ボルテックスし、37～40℃で15分間インキュベートします。

ステップ7 1mLピペッターと滅菌済みチップを用いて、900μLのイソプロパノール（2-プロパノール）を混合液に加えます。色の変化はほとんどないはずです。10～15秒間ボルテックスし、室温で15分間インキュベートします。

ステップ8 マイクロフュージで15分間遠心（10,000xg）し、DNAをペレット化します。グリコーゲンが沈殿したDNAを包んでいるため、白いペレットが見られる場合があります。得られた上清を静かに流し、チューブを吸水性のあるペーパータオル（ほこりのない実験用ウェットティッシュ）の上でブロットし、チューブに残った溶液をできるだけ取り除きます。ペーパータオルの清潔な部分を各チューブに使用します。ペーパータオルの上でチューブをたたくと、ペレットが外れることがあるので注意します。

¹ ヨウ化ナトリウム溶液は、4℃で保存中に結晶が生じることがあるが、50℃に短時間加温すれば再溶解します。

² 洗浄液Bはグリコーゲン溶液添加後、4℃で1週間のみ安定です。グリコーゲン溶液を含む洗浄液Bを1週間以内に使用しない場合は、抽出に使用する前にグリコーゲン溶液を再度添加する必要があります。

ステップ9 チューブに750μLの洗浄液Aを加えます。キャップをし、ボルテックスミキサーで5～15秒間攪拌し、ペレットをチューブに懸濁させます。

ステップ 10 マイクロフュージ（10,000xg）で5分間遠心し、得られた上清をチューブから静かに注ぎます。ブロッティングは不要です。

ステップ11 チューブにグリコーゲン溶液を含む洗浄液Bを1500μL加えます。キャップをし、ボルテックスミキサーで5～15秒間激しく混合します。

ステップ12 マイクロフュージ（10,000xg）で5分間遠心し、上清を静かに注ぎます。チューブを清潔なペーパータオルの上で一度ふやかしてよく水を切ります。

ステップ13 残りのペレット（グリコーゲンとDNAを含む）を0.5mLのZero Calibratorに懸濁します。ボルテックスミキサーで混合し、ペレットを可溶化します。

ステップ14 サンプルを105℃で15分間加熱し、DNAを変性させます。氷上で5分間冷やし、Threshold Total DNAアッセイで検査します。

代替アッセイ手順

消化サンプルの抽出

サンプルのろ過がうまくいかなかったり、直接抽出後に完全なスパイク回収ができなかったりした場合は、 Proteinase KとSDSを用いた一晩の消化が必要になることがあります。Threshold System Operator's Manualに概説されているプロトコールでは、DNAスパイクの有無にかかわらず、0.5 mLのサンプルに2mg/mLのProteinase Kを25 µL、2%のSDSを25 µL添加し、その後55℃で一晩インキュベートします。消化の後に非フェノール抽出を行う場合は、25 µL の 20% SDS を使用して消化をさらに促進することができます。20%SDSによるタンパク質消化の後にこの抽出手順を行う場合は、ペレットの追加洗浄が必要です：

• 消化後、ステップ#8までの手順で説明したようにサンプルを抽出します。沈殿したサンプルを洗浄液B（グリコーゲン溶液を加えたもの）1mLに懸濁し、ボルテックスミキサーで5～15秒間混合します。
• 遠心（10,000×g）し、上清を静かに取り除きます。標準手順のステップ#9に進みます。

0.5mlを超えるサンプル量の抽出

方法A
同一チューブ内のサンプル500 µLアリコートを複数回抽出します。最初の500 µLアリコートは、手順のステップ#1～8で説明したように処理できます。ペレットを再懸濁するため、同じチューブに2回目のサンプル500µLアリコートを加え、グリコーゲン溶液を加えずにヨウ化ナトリウム溶液を使用して手順#5～8を繰り返します。必要なサンプル量に合わせてこの手順を繰り返すことができますが、バックグラウンド率が上昇する可能性があります。最終的に得られたペレットを洗浄し、手順#9～14で概説した手順に従ってゼロキャリブレーターに再懸濁します。

方法B
この方法では、抽出キットの成分の添加量を比例して増やすことで、サンプル量を増やして抽出することができます。滅菌済みスクリューキャップNUNCバイアルを使用することで、より大量のサンプルに対応でき、適切な遠心ローターサイズを選択する必要があります。沈殿した最終ペレットを0.5mLのゼロキャリブレーターに懸濁し、2.0mLのサルステットチューブに移します。(注：現在までのところ、この方法で試験されたのは1mLサンプル量のみです)。

0.5 mL の検体分注 2 本と 5 mg/ mL のモノクローナル抗体 1 mL の検体分注 1 本を用いて、前述の両方のプロトコルを比較したところ、どちらも許容できるスパイク回収率が得られました（表 1）。

表1 増量抽出法の比較

応用例

多くのタンパク質サンプルをこの方法で抽出し、Threshold Total DNA アッセイで試験しました。サンプルは、子牛胸腺 DNA の添加の有無にかかわらず、3 回抽出し、アッセイしました。スパイクを完全に回収できた各試料の最大抽出量を表 2 に示します。

表2：フェノールフリーDNA抽出法で試験したサンプル。*サンプルは抽出前に50 µg Proteinase Kと0.1% SDSで一晩消化しました。

いくつかのタンパク質（モノクローナル抗体の一部など）は、Proteinase KとSDSによる前処理なしで抽出およびアッセイできます。

概要

本抽出法は、Threshold Total DNAAssayで検査するサンプルの前処理として、従来のフェノール/クロロホルム抽出に代わる方法です。DNA とイオン結合しない可溶性タンパク質の場合、この抽出法は選択的沈殿によりサンプル DNA を分離します。これにより、サンプルDNAが干渉タンパク質や緩衝液成分から分離され、サンプルをZero Calibratorに再懸濁することができます。この方法は、タンパク質が高いpIを示し、サンプルDNAと結合する場合に特に効果的です。イオン結合を減らすために、抽出前にサンプルのpHをタンパク質のpI以上に上げることができます。抽出されたDNAはZero Calibratorに再懸濁されるため、後でpHを中性に調整する必要はありません。この抽出法では、0.5 mLを超える容量の検査も可能であるため、1回の検査でより大量のサンプルを検査することができます。

参考文献

1. ヒト血清からのDNA単離の簡単な手順。Nucleic Acids Research, 19: 5792 (1991).
2. Maniatis, T., Fritsch, E.F., and Sambrook, J. Molecular Cloning - A Laboratory Manual, second edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

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