Application Note 新しいSpectraMax Lを用いた96ウェルおよび
384ウェルフォーマットのデュアルルシフェラーゼアッセイ
PDF版（英語）
はじめに
キャシー・オルセン（Ph.D.）著
レポーター遺伝子アッセイは、真核生物遺伝子の発現を研究するために用いられる。デュアルレポーター遺伝子アッセイでは、細胞は2つのベクターでトランスフェクトされる。1つ目は目的の制御プロモーターに結合した実験レポーター遺伝子を含み、2つ目は構成プロモーターに結合したコントロールレポーター遺伝子を含む。実験レポーターの活性をコントロールレポーターに対して正規化することで、実験のばらつきを最小限に抑えることができる。
ホタルとレニラのルシフェラーゼを用いた生物発光レポーターシステムは、どちらもアッセイが簡単で感度が非常に高いため、共同レポーターとして広く使用されている。プロメガ社のDual-Luciferase® Reporter Assay Systemは、ホタルとレニラの両方のルシフェラーゼ活性を一つのマイクロプレートウェルで測定することができ、ホタルは実験レポーターとして、レニラはコントロールとして機能します。両方の反応は、Molecular Devices社の新しいSpectraMax® Lマイクロプレートルミノメーターで簡単に測定できます。この装置は96ウェルプレートと384ウェルプレートの両方でデュアルルシフェラーゼアッセイを測定するのに理想的で、SoftMax Pro®ソフトウェアにより、あらかじめ設定されたプロトコールでデータ収集と解析が簡素化される。SpectraMax Lで得られたデュアルルシフェラーゼアッセイ結果の一例をご紹介します。
材料
- ホタルルシフェラーゼ (Sigma Cat. #L9506)
- レニラルシフェラーゼ (Chemicon Cat. #4400)
- Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega Cat. #E1960)；内容はLuciferase Assay Buffer II、Luciferase Assay Substrate、Stop & Glo® Buffer、Stop & Glo Substrate、5x Passive lysis buffer。
- 白色96ウェルおよび384ウェルLumitrac 200マイクロプレート（Greiner Cat.）
- SpectraMax Lマイクロプレート輝度計とSoftMax Proソフトウェア（Molecular Devices社製）
方法
受動溶解バッファー は、5xストックを脱イオン水で希釈して調製した。ホタルルシフェラーゼのストック（1 mg/mL）は、1%ウシ血清アルブミン（BSA）を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で調製し、使用まで-70℃で凍結保存した。アリコートを必要に応じて解凍し、1 mg/mL のストック 10 µL を 990 µL の継代溶解バッファーで希釈して 10 µg/mL の標準液を調製した。レニラ・ルシフェラーゼ・ストック（10 µg/mL）は、10 µg の酵素バイアルに 990 µL の受動溶解バッファー を加え、穏やかに混合することにより調製した。溶液（10 µg/mL）をアリコートに分け、使用まで-70℃で凍結した。デュアルルシフェラーゼワーキングスタンダード#1は、10µg/mLのホタルルシフェラーゼと10µg/mLのレニラルシフェラーゼをそれぞれ10µLずつ、980µLの受動溶解バッファーで希釈して調製した（各酵素濃度=100 ng/mL）。受動溶解バッファーで1～10倍に連続希釈すると、両酵素とも10-5～10-1 pg/mLの実用標準濃度が得られた。Luciferase Assay Reagent II (LAR II) と Stop & Glo Reagent は、Dual-Luciferase Reporter Assay System テクニカルマニュアルに従って調製した。
SpectraMax LのPインジェクターにはLAR IIを1.2mL、MインジェクターにはStop & Glo試薬を1.2mLプライムした。SoftMax Proでは、デュアルリードモードが選択されました。PとMの両インジェクターは、100µL（96ウェルプレート）または25µL（384ウェルプレート）を、2秒のディレイと10秒の積分時間で供給するように設定されました。酵素濃度が2 fg/well～2x106fg/well（96-wellプレート）または1 fg/well～106fg/well（384-wellプレート）の範囲になるように、各ルシフェラーゼ標準物質20 µL（96-wellプレート）または10 µL（384-wellプレート）をアッセイウェルにピペッティングした。各アッセイプレートをSpectraMax Lの引き出しに入れ、読み取りを開始した。データ解析とグラフ化はSoftMax Proソフトウェアを用いて行った。
結果
図1は、96ウェルプレートで行ったデュアルシフェラーゼアッセイの結果を示している。このアッセイのダイナミックレンジは約5桁に及んだ。最低標準物質までのアッセイの直線性が示すように、感度は非常に優れている。384ウェルアッセイ（図2）でも同様の結果が得られ、SpectraMax Lが低容量フォーマットで卓越した試薬混合と感度を提供することが実証されました。
概要
SpectraMax Lは、卓越した感度、柔軟性、自動化機能、検証ツールを提供する発光専用マイクロプレートリーダーです。デュアル高速液体インジェクターにより、SpectraMax Lは96ウェルおよび384ウェルフォーマットのフラッシュおよびグロー発光検出アプリケーションを簡単に実行できます。特に、Molecular Devices社のStakMax™マイクロプレートスタッカーと組み合わせることで、アッセイ開発やハイスループットのアプリケーションに適しています。特に、Molecular Devices社のStakMax™マイクロプレートスタッカーと組み合わせることで、デュアルルシフェラーゼアッセイを384ウェルフォーマットで行うことができ、感度を損なうことなく試薬を大幅に節約できることを実証しました。
詳細については、当社ウェブサイト（www.moleculardevices.com/spectramax）をご覧になるか、電子メール（Cathy.Olsen@moldev.com）でお問い合わせください。
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