Application Note EarlyTox 心毒性キットによる創薬初期の心毒性評価
細胞ベースアッセイで迅速・高感度に検出

はじめに

創薬初期段階において心毒性を評価することは、潜在的に毒性を持つ化合物を早期に除外し、開発の効率化とコスト削減を図る上で重要です。心毒性評価においては、生物学的に関連性が高く、予測性に優れたin vitroアッセイが求められており、ハイスループットスクリーニングに適したアッセイは特に有用です。幹細胞由来の心筋細胞は、GPCRやイオンチャネルを発現し、自発的な機械的・電気的活動を示すことから、ネイティブな心筋細胞に近いモデルとして注目されています。

EarlyTox™ 心毒性キットは、心筋細胞の拍動に関連する細胞質カルシウムの変化を測定するために最適化された新規カルシウム感受性色素と独自のマスキング技術を含んでいます。拍動パターンの特性評価には短い積分時間が必要であり、短時間のカメラ露光では、細胞内で色素に結合したカルシウムによるシグナルは従来のカルシウムフラックスアッセイよりも小さくなります。本キットの新しい色素は、他の市販カルシウム指示薬と比較して著しく明るい蛍光を発します。図1に示すように、クエンチ技術は細胞内には侵入せず、細胞外のバックグラウンド蛍光を低減します。これらの特長により、シグナルウィンドウが改善され、拍動パターンの詳細な解析が可能になります。

本アッセイキットは、薬理学的化合物が拍動頻度（BPM）、ピーク振幅、拍動パターンに与える影響を評価するために使用でき、幹細胞由来心筋細胞または初代心筋細胞との併用が可能です。拍動頻度は、EarlyTox 心毒性色素によってモニタリングされる細胞内Ca²⁺濃度の変化から算出されます。拍動サイクル中、筋小胞体が刺激されることでCa²⁺が細胞質に放出され、カルシウムがトロポニンに結合してサルコメアを活性化し、細胞が収縮します。この際、細胞質内の遊離カルシウムに色素が結合することで蛍光シグナルが増加します。細胞の弛緩は、筋小胞体のカルシウム取り込みポンプや細胞外液とのカルシウム交換によって細胞質からカルシウムが除去されることで起こり、蛍光シグナルは減少します。このサイクルが繰り返されることで、拍動に同期した蛍光ピークが観察されます。

EarlyTox 心毒性キットを用いた心筋細胞でのカルシウムピーク頻度の濃度依存的な変化および非典型的な拍動パターンは、FLIPR® TetraシステムとScreenWorks® Peak Proソフトウェアによって検証・特性評価されています。カルシウムピークの頻度、振幅、ピーク幅、立ち上がり時間および減衰時間などのパラメータの変化を解析することで、構造活性相関（SAR）の方向性を見直したり、心毒性の懸念がある化合物を創薬候補から除外したりする判断が可能になります。さらに、この手法は心機能に影響を与える新規化合物の探索にも応用できます。

材料と方法

本アッセイでは、Cellular Dynamics International社のヒトiPS細胞由来心筋細胞（iCell Cardiomyocytes）を、推奨プロトコールに従って培養しました。細胞は実験の10～14日前に、384ウェルの黒壁透明底プレートに播種しました。EarlyTox 心毒性エクスプローラーキット（R8210）の色素ローディングバッファーは、心筋細胞の拍動を低下させないよう37°Cに加温してから添加しました。プレート内の細胞25 µLに対して色素25 µLを加え、5% CO₂、37°Cで2時間インキュベートしました。

キットに含まれる3種類の参照化合物（プロプラノロール、イソプロテレノール、ソタロール）を用いて、iPSC心筋細胞に対する多様な影響を評価しました。濃度反応を含む化合物プレートは、最終濃度の5倍でComponent Bバッファーに調製し、細胞への温度影響を最小限に抑えるために添加前に37°Cに加温しました。FLIPR Tetraシステムで化合物を添加後、細胞の拍動頻度とパターンを最大4～6時間にわたりモニタリングしました。化合物添加後10分で再度プレートを測定し、さらに複数の時間点で最大4時間まで追加測定を行いました。

結果

EarlyTox 心毒性キットに含まれる3種類の参照化合物とコントロールにおける拍動頻度および拍動パターンの変化を、図2～図5に示します。

カルシウム色素の比較

複数のカルシウム指示薬について、細胞の拍動能力、平均ピーク振幅、ピーク頻度への影響を4時間にわたり比較しました。比較対象には、EarlyTox 心毒性キット、FLIPR® Calcium 5 Assay Kit（モレキュラーデバイス）、Fluo-4 Direct キット（Invitrogen）が含まれます。各色素は、ベンダーの推奨プロトコールに従ってiPSC心筋細胞にローディングされました。化合物添加前および複数の時間点で、FLIPR Tetraシステムにより測定を行いました。本実験ではコントロールウェルもモニタリングされています。図6および図7に示すように、EarlyTox 心毒性キットは、ピーク頻度およびシグナル振幅の両方において最も高い値を示しました。図8に示すように、化合物添加から4時間後でも、EarlyTox 心毒性色素は細胞の拍動能力（拍動の消失）に影響を与えませんでした。一方、FLIPR Calcium 5 Kitでは多くのウェルで拍動が消失し、Fluo-4 Direct キットでは化合物添加から90分後にはすべてのウェルで拍動が消失しました。

注文情報

結論

EarlyTox 心毒性キットは、幹細胞由来心筋細胞に対する薬理学的化合物の影響を評価するために最適化された、堅牢でハイスループットなアッセイ手法を提供します。最適化された色素フォーミュレーションにより、最大のシグナルウィンドウを実現し、非特異的な毒性を大幅に低減することで、拍動頻度、ピーク頻度、シグナル振幅への影響を最小限に抑えます。これは、他の市販色素では見られない特長です。FLIPR Tetraシステムと組み合わせることで、EarlyTox 心毒性キットは創薬プロセスの初期段階において、心毒性のある化合物を早期に除外し、心疾患治療薬候補の特定を可能にする強力なツールとなります。これにより、より効率的かつ的確なドラッグデザインが可能になります。

以下などのモレキュラーデバイス システムと互換性があります。

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