Application Note SpectraMax i3x マルチモードプレートリーダー上の
EarlyTox Caspase-3/7 NucView 488アッセイキット

  • 蛍光マイクロプレートリーダーおよび蛍光イメージャーに最適化
  • 試薬添加のみのシンプルなワークフロー
  • バックグラウンド蛍光を低減するマスキング試薬（オプション）
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はじめに

アポトーシスは、胚発生などの正常な過程だけでなく、癌や神経変性疾患などの疾患においても、細胞のプログラム死を引き起こす重要なメカニズムです。アポトーシスのアッセイは、様々なイメージングリーダーやマイクロプレートリーダーを用いて行うことができ、正常および疾患に関連した細胞死のメカニズムに関する貴重な情報をご提供します。

EarlyTox™ Caspase-3/7 NucView™ 488アッセイキットは、NucView 488 Caspase-3基材を使用することにより、完全細胞集団におけるアポトーシスの検出を可能にします。この基質は、カスパーゼ-3/7 DEVD認識配列に結合した蛍光性DNA色素から構成されています。最初は蛍光を発しないが、細胞膜を透過し、細胞がアポトーシス状態であれば、基材はCaspase-3/7によって切断され、核に入りDNAに結合する色素を放出し、明るい緑色の蛍光を発します。

多くの蛍光ベースのアポトーシスアッセイは、顕微鏡またはイメージングシステムでの使用にのみ最適化されているが、EarlyTox Caspase-3/7 NucView 488アッセイはその両方に最適化されています。ここでは、SpectraMax® MiniMax™ 300イメージングサイトメーターまたはSpectraMax® i3x マルチモードマイクロプレートリーダーを使用して、この柔軟なアッセイを実行する方法を示します（図1）。SoftMax® Proソフトウェアには、プレートリーダーの結果を自動計算するための設定済みプロトコルが含まれています。

図1：EarlyTox Caspase-3/7 NucView 488アッセイのワークフロー。

材料

  • EarlyTox Caspase-3/7-D NucView 488アッセイキット
    ◦DMSO製剤
    ◦*
    　▫エクスプローラーキット（2プレートサイズ、モレキュラーデバイス P/N R8348）
    　▫バルクキット（10プレートサイズ、モレキュラーデバイス P/N R8349）
  • EarlyTox Caspase-3/7 NucView 488アッセイキット
    ◦PBS製剤
    　▫エクスプローラーキット（2プレートサイズ、モレキュラーデバイス P/N R8350）
    　▫バルクキット（10プレートサイズ、モレキュラーデバイス P/N R8351）
  • HeLa細胞（ATCC）
  • スタウロスポリン（Sigma）
  • 96ウェル黒色透明底マイクロプレート（Corning）
  • SpectraMax i3x マルチモードマイクロプレートリーダー
  • SpectraMax® MiniMax® 300イメージングサイトメーター

方法

HeLa細胞を96ウェル黒色透明底マイクロプレートに100μLの培地中で、1ウェルあたり15,000個プレーティングしました。37℃、5％CO2インキュベーター内で一晩接着させ、増殖させました。その後、アポトーシスを誘導するために、5 µMから0.005 µMまでのスタウロスポリンの1:2希釈系列で20時間処理しました。

NucView 488基質の10 µM 2X作業溶液を培地で調製しました。100µLの作業用基材溶液を、100µLの細胞と培地を封じ込めたウェルに直接加え、最終濃度を5µMとしました。細胞を遮光し、室温で15～30分間インキュベートしました。SpectraMax MiniMax 300イメージングサイトメーターで541 nmの緑色蛍光チャンネルを使用してイメージングを行うか、SpectraMax i3x マルチモードマイクロプレートリーダーで励起波長490 nm、蛍光波長535 nmで検出しました。

マイクロプレートリーダーで検出する場合、キットに含まれるオプションのMasking Reagentを、細胞基材のインキュベーション終了後に細胞に添加しました。マスキング試薬はキットの推奨希釈率（Explorerキットの場合、通常1：4希釈）で細胞に添加しました。マスキング試薬の添加後、直ちにプレートリーダーでプレートの下方測定を行いました。

結果

スタウロスポリンで処理したHeLa細胞はアポトーシス反応を示し、EarlyTox Caspase-3/7 NucView 488 アッセイを用いて検出および定量することができました。蛍光標識したアポトーシス細胞を、SpectraMax i3x マルチモードマイクロプレートリーダーとSpectraMax MiniMax 300イメージングサイトメーターを用いて検出しました。

SpectraMax® MiniMax® 300イメージングサイトメーターで撮像したアポトーシス細胞を同定し（図2）、SoftMax Proソフトウェアを用いて解析しました。アポトーシス細胞数対スタウロスポリン濃度をグラフ化し、 4-parameter curve fitを適用した結果、EC50値0.10μMの濃度反応曲線が得られました（図3）。

図2：HeLa細胞をスタウロスポリンで20時間処理し、アポトーシスを誘導しました。NucView 488基質を最終濃度5 µMで添加しました。SpectraMax MiniMax® 300イメージングサイトメーターの緑色（541 nm）蛍光チャンネル（上）と透過光チャンネル（下）を用いて細胞をイメージングしました。

図3. SpectraMax® MiniMax® 300イメージングサイトメーターでイメージングしたスタウロスポリン処理HeLa細胞の濃度反応曲線です。アポトーシス（緑色蛍光）細胞は、SoftMax Proソフトウェアを用いて画像中で同定し、カウントしました。EC50 = 0.10 µM。

SpectraMax i3x マルチモードマイクロプレートリーダーで検出したアッセイでも、スタウロスポリンに対するHeLa細胞の濃度依存的反応が示されました（図4、上）。プレートリーダーは、蛍光を背景にした個々の細胞ではなく、ウェルごとの総蛍光を検出するため、結果として得られる曲線はプラトーに達しないです。しかし、プレートを読み取る直前にマスキング試薬をウェルに添加すると、バックグラウンド値が減少し、その結果、イメージングで得られたものと同様の、EC50値0.32 μMの完全な4パラメータ濃度応答曲線が得られました（図4、下方）。

図4：HeLa細胞をスタウロスポリンで20時間処理してアポトーシスを誘導しました。NucView 488基質（DMSO製剤）を最終濃度5μMで添加しました。カスパーゼ活性に対応する蛍光を、SpectraMax i3x マルチモードマイクロプレートリーダーを用いて測定しました。上：マスキング試薬なしのアッセイ。下： マスキング試薬をウェルに添加し、バックグラウンドを減少させたアッセイ（EC50 = 0.32 µM）。

結論

EarlyTox Caspase-3/7 NucView 488アッセイキットは、SpectraMaxマイクロプレートリーダーまたはSpectraMax MiniMax 300イメージングサイトメーターと併用することで、アポトーシスの定量に柔軟なアプローチをご提供します。アポトーシス細胞は、ウェルあたりの総蛍光の関数として直接測定することも、個々の細胞をイメージングしてカウントすることもでき、どちらの方法でも同等の結果が得られます。オプションのMasking Reagentは、バックグラウンド蛍光を減少させ、EC50値をより正確に算出することができます。NucView 488 基質には2種類の製剤があります： DMSOとPBSです。PBS製剤は、DMSOに感受性のある細胞に使用できます。

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