Application Note SpectraMax蛍光マイクロプレートリーダーでの
EarlyTox Caspase-3/7 R110アッセイキット
- 単一試薬添加によるシンプルなワークフロー
- マイクロプレートフォーマットによるスループットの向上
- SoftMax Pro ソフトウェアにプリセットされたプロトコール
PDF版（英語）
はじめに
アポトーシスは、胚発生などの正常なプロセスや、がんや神経変性疾患などの病態において細胞死を引き起こす高度に制御された細胞プログラムです。アポトーシスのアッセイは、さまざまなイメージングまたはマイクロプレートリーダー検出システムを用いて実施でき、正常および疾患関連の細胞死メカニズムに関する重要な情報を提供します。
EarlyTox™ Caspase-3/7 R110アッセイキットは、マイクロプレートリーダー専用に設計された単一ステップの均一アッセイを提供します。蛍光基質 (Ac-DEVD)₂-R110 は、2つの DEVD コンセンサスターゲット配列を含み、細胞溶解液中で酵素により2段階で完全に加水分解されます。両方の DEVD ペプチドの加水分解により、緑色蛍光色素ローダミン110（R110）が放出され、励起波長490 nm、蛍光波長520 nmで大幅な蛍光増加が得られます。図1に示すように、簡略化されたワークフローにより、アッセイに必要な細胞数を減らし、複数ステップで生じるばらつきも低減します。
図1：EarlyTox Caspase-3/7 R110アッセイのワークフロー
このアプリケーションノートでは、EarlyTox™ Caspase-3/7 R110アッセイキットと SpectraMax® 蛍光マイクロプレートリーダーの組み合わせについて報告します。R110染料の蛍光シグナルは SpectraMax マイクロプレートリーダーで検出でき、SoftMax® Pro ソフトウェアにプリセットされたプロトコールを用いて迅速に解析できます。
材料
- EarlyTox Caspase-3/7 R110アッセイキット
◦Explorerキット（2プレートサイズ）： モレキュラーデバイス
◦バルクキット（10プレートサイズ）： モレキュラーデバイス - HeLa細胞（ATCC）
- スタウロスポリン（Sigma）
- 96ウェル黒色透明底マイクロプレート（Corning）
- SpectraMax蛍光マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）
方法
HeLa細胞を96ウェル黒色クリアボトムマイクロプレートに、1ウェルあたり20,000細胞、培地100 μLで播種しました。37°C、5% CO₂インキュベーターで一晩付着・増殖させた後、スタウロスポリンを5 μMから0.04 μMまでの1:2希釈系列で4時間処理し、アポトーシスを誘導しました。
基質アッセイバッファは、酵素基質 (Ac-DEVD)₂-R110（2 mM）を細胞溶解／アッセイバッファに50 μL対1 mLの比率で添加して調製しました。各ウェルに基質アッセイバッファ100 μLを添加し、最終容量200 μL、基質最終濃度50 μMとしました。サンプルは室温で35分、1.5時間、または3時間インキュベートしました。蛍光は SpectraMax i3 マルチモードマイクロプレートリーダーで測定し、設定は表1に示します。比較のため、R110由来カスパーゼ基質を使用する競合アッセイも実施しました（図2）。
| *下方からの読取式を推奨しますが、この機能がない場合は、上方読取式でもよいです。 | |
|---|---|
| パラメータ | 設定 |
| 読み取りモード | 蛍光 |
| 読み取りタイプ | 終点 |
| 波長 |
励起 = 490 nm 発光 = 520 nm |
| PMTと光学系 |
PMTゲイン： 自動 フラッシュ/リード：10 下方から測定を行います*。 |
表1. SpectraMax 蛍光マイクロプレートリーダーの最適化設定
図2. EarlyTox Caspase-3/7 R110アッセイのワークフローと競合アッセイの比較
結果
スタウロスポリンで4時間処理したHeLa細胞は、EarlyTox™ Caspase-3/7 R110アッセイキットを用いて測定されたアポトーシス応答を示しました。蛍光は SpectraMax i3 マルチモードマイクロプレートリーダーで検出され、SoftMax Pro ソフトウェアで4パラメータカーブフィットを用いてグラフ化しました。基質で35分、1.5時間、3時間インキュベートした細胞は、類似した EC₅₀値を示しました（図3）。
図3：スタウロスポリンで4時間処理したHeLa細胞の濃度応答曲線 基質インキュベーション時間は35分（•）、1.5時間（•）、3時間（•）。アッセイプレートは SpectraMax i3 マルチモードマイクロプレートリーダーで読み取り、SoftMax Pro ソフトウェアでグラフ化。得られた EC₅₀値はそれぞれ0.61 μM、0.54 μM、0.52 μM。
競合キットと比較すると、EarlyTox R110アッセイキットは結果取得までのステップが少なく、すべての操作をマイクロプレートウェル内で直接実施でき、サンプル移送や煩雑な操作は不要です（図2）。さらに、競合キットでは1データポイント取得に96ウェルプレートの4ウェル分の細胞をプールする必要がありますが、EarlyTox R110アッセイでは各ウェルから個別のデータポイントを取得できます。これにより、複数のレプリケート実施や標準偏差の算出が可能になります（図4）。
図4：EarlyTox Caspase-3/7 R110アッセイキットと競合キットのデータ比較 濃度応答曲線から算出した EC₅₀値は EarlyTox R110が0.61 μM（•）、競合キットが0.54 μM（•）。
結論
EarlyTox™ Caspase-3/7 R110アッセイキットと SpectraMax 蛍光マイクロプレートリーダーを組み合わせることで、マイクロプレートフォーマットによるスループット向上と、アポトーシス測定のための簡略化されたワークフローを提供します。競合キットとは異なり、EarlyTox R110アッセイでは複数ウェルのサンプルをプールする必要がなく、96ウェルプレートのすべてのウェルから個別のデータポイントを取得できます。さらに、単一試薬添加ステップのみで追加のサンプル操作が不要なため、迅速な結果取得が可能です。
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