Application Note SpectraMax蛍光マイクロプレートリーダーでの
EarlyTox Live/Deadアッセイキット

はじめに

細胞生存率アッセイは、薬剤候補、パスウェイ活性化剤・ 阻害剤、レポーター遺伝子など、様々な治療の効果を評価するためにしばしば行われます。細胞生存性をアッセイする最も一般的な方法の一つは、マイクロプレートリーダーでの蛍光検出です。ここでは、EarlyTox™  Live/DeadアッセイキットとSpectraMax® 蛍光マイクロプレートリーダーを組み合わせて使用した結果をご報告します（図1）。

EarlyTox Live/Deadアッセイキットには、哺乳動物細胞での使用に適した生細胞または死細胞のマーカーが2種類含まれています。カルセイン AM は広く使用されている生細胞マーカーです。非蛍光性のカルセインAMは無傷の細胞膜を透過し、細胞内のエステラーゼによって蛍光性のカルセインに変換されます。生細胞は細胞質内で強い緑色蛍光で染色されます。細胞増殖アッセイや、生細胞染色のみを必要とするその他のアッセイでは、EarlyTox™ Live Cell  アッセイキット（Explorer kitのP/N R8342、Bulk kitのP/N R8343）に含まれるように、カルセインAMを単独の試薬として使用することができます。

エチジウムホモダイマー-III（EthD-III）は実質的に無蛍光で、無傷の細胞膜に対して不透過性です。細胞死を伴う細胞膜の完全性が損なわれた場合、EthD-IIIは細胞内に入り、核酸に結合し、死細胞で明るい赤色の蛍光を発します。細胞膜の完全性に影響を及ぼす細胞毒性イベントは、この方法を用いて正確に評価できます。

カルセインおよびEthD-IIIからの蛍光シグナルは、SpectraMax蛍光マイクロプレートリーダーを用いて検出することができ、SoftMax® Proソフトウェアの設定済みプロトコルを用いて迅速に解析し、生細胞と死細胞の相対量を決定することができます。

図1: EarlyTox Live/Deadアッセイのワークフロー

材料

• EarlyTox Live/Deadアッセイキット
  ◦Explorerキット（2プレートサイズ）： モレキュラーデバイス P/N R8340
  ◦バルクキット（10プレートサイズ）： モレキュラーデバイス P/N R8341
• HeLa細胞（ATCC）
• スタウロスポリン（Sigma）
• 96ウェル黒色透明底マイクロプレート（Corning）
• SpectraMax蛍光マイクロプレートリーダー

方法

HeLa細胞を100μLの培地中、1ウェルあたり15,000個、黒色透明底マイクロプレートにプレーティングしました。37℃、5％CO₂インキュベーター内で一晩培養しました。その後、アポトーシスを誘導するために、10μMから0.01μMまでのスタウロスポリンの1:2希釈液で24時間処理しました。各濃度で4複製を行いました。

カルセインAM/EthD-IIIの2X作業溶液は、カルセインAMとEthD-IIIのストック溶液をPBSに加え、各色素の濃度が6 µMになるように調製しました。100μLの2X作業溶液を各アッセイウェルに加え、最終容量を200μLとし、各染料の最終濃度を3μMとしました。プレートを室温で 50 分または 2.5 時間インキュベートしました。その後、SpectraMax® i3 マルチモードマイクロプレートリーダーを用い、SoftMax Proソフトウェアであらかじめ設定したプロトコルを用いて、表1に示した設定でプレートを下から読み取りました。注意：メデュームを除去した後、カルセインAMとEthD-IIIの1X溶液を添加することは任意であり、必要であればバックグラウンド蛍光を減少させるのに役立ちます。

表1. SpectraMax i3 マルチモードマイクロプレートリーダーの設定。蛍光検出機能を持つ他の SpectraMax マイクロプレートリーダーでも同様の設定が可能です。Bottom readを推奨しますが、この機能がない場合はtop readを使用してもかまいません。

SoftMax Pro ソフトウェアの設定済みEarlyTox Live/Deadアッセイプロトコールは、緑色／赤色比を自動的に計算し、化合物濃度などの実験条件に対してプロットすることができます。このプロトコールでは、実験細胞サンプル中の生細胞と死細胞の割合も計算できます。これらの計算を行うには、アッセイプレートに追加のコントロールをセットアップする必要があります *1。

結果

スタウロスポリンで処理したHeLa細胞は明確な濃度反応を示し、これは生細胞（緑色蛍光）と死細胞（赤色蛍光）のシグナル比として容易に定量できました（図2）。全体として、RFU値は50分間インキュベートした細胞よりも2.5時間インキュベートした細胞の方が高かったです。しかし、スタウロスポリン処理による緑色／赤色比の増加倍率は、どちらの時点でも同じでした。このように経時的な増加倍率が安定しているため、インキュベーション時間を柔軟に変更しても一貫した結果が得られます。どちらの場合も、EC₅₀値はそれぞれ200 nMと207 nMで同等でした。

結論

SpectraMaxマイクロプレートリーダーと併用することで、EarlyTox Live/Dead アッセイキットは、シンプルなワークフローとマイクロプレートフォーマットによるスループットの向上により、生細胞と死細胞の直接測定を可能にします。幅広いインキュベーション時間にわたって一貫した結果が得られ、ワークフローの柔軟性を提供します。SoftMax Proソフトウェアの設定済みプロトコールは、装置の設定を最適化し、自動データ解析により結果までの時間を短縮します。

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